PRRSV XH-GD株Nsp2部分缺失感染性克隆的構(gòu)建

張民澤，謝杰雄，郭泗虎，王 衡，閆明菲，趙孟孟，黃 震，粟 碩，孫 龍，張桂紅

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510642)

豬繁殖與呼吸障礙綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由 PRRS病毒(PRRSV)引起的一種以妊娠母豬嚴(yán)重繁殖障礙以及仔豬的呼吸道癥狀和高死亡率為特征的高度接觸性傳染病[1]。Nsp2具有半胱氨酸蛋白酶活性(Cysteine proteinse，Cp)，介導(dǎo)Nsp2/Nsp3切割，也是PRRSV感染細(xì)胞后最早復(fù)制及特異性的蛋白之一，也是Nsp4絲氨酸蛋白酶的輔助因子[2]。不同病毒株間Nsp2編碼區(qū)差異較大，可能與病毒對(duì)細(xì)胞或組織的嗜性有關(guān)。2006年國(guó)內(nèi)分離的高致病性PRRSV(HP-PRRSV)在其N(xiāo)sp2編碼區(qū)第483位和535位～563位存在不連續(xù)的30個(gè)氨基酸的缺失[3]，推測(cè)其致病力增強(qiáng)可能與Nsp2區(qū)域的缺失有關(guān)。但隨后有研究證明該缺失與毒力增強(qiáng)無(wú)直接關(guān)系[4]。相關(guān)研究表明Nsp2上的免疫顯性表位不是病毒復(fù)制所必需，但在宿主的適應(yīng)性免疫應(yīng)答反應(yīng)中起到一定作用[5]。Nsp2半胱氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域抑制IFN的調(diào)節(jié)因子IRF-3的激活[6]。這些研究表明，PRRSV Nsp2缺失型病毒株在感染動(dòng)物機(jī)體的過(guò)程中發(fā)揮一定的作用。

本實(shí)驗(yàn)在PRRSV XH-GD Nsp2編碼區(qū)缺失部分氨基酸序列，構(gòu)建Nsp2部分缺失株的全長(zhǎng)cDNA的重組質(zhì)粒，并對(duì)拯救的重組病毒進(jìn)行鑒定，進(jìn)而研究這些缺失區(qū)域?qū)Σ《緩?fù)制的影響。

1.3 Nsp2蛋白部分缺失區(qū)域的選擇 根據(jù)序列比對(duì)分析表明Nsp2的321位～530位處于Nsp2可耐受插入或缺失突變等操作的中間高變區(qū)，同時(shí)該位置包括了自然29+1個(gè)氨基酸不連續(xù)缺失中的480位缺失，以及3個(gè)最新鑒定的抗原表位，為了解Nsp2該區(qū)域的生物學(xué)特性，選擇出下列區(qū)域進(jìn)行缺失研究。缺失位置如圖1所示：

1.4 引物的設(shè)計(jì)及合成 在本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的DNA-launched的反向遺傳操作平臺(tái)-PRRSV XH-GD株全長(zhǎng)感染性克隆的基礎(chǔ)上進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)[7]。應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物用于擴(kuò)增缺失部位的上游和下游片段(表1)，對(duì)A1片段進(jìn)行改造。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1 材料和方法

1.1 病毒株、菌株、細(xì)胞及相關(guān)載體 美洲型HP-PRRSV XH-GD株、Marc-145細(xì)胞和BHK細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室保存；感受態(tài)細(xì)胞DH5α購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；低拷貝載體pOKq、含有部分PRRSV基因片段的重組質(zhì)粒pJET-CMV-A1、pJET-A2(q)、pOK-BCD(c)及 PRRSV全長(zhǎng) cDNA的重組質(zhì)粒pOK-A2BCD由本實(shí)驗(yàn)室制備保存。

1.2 主要試劑 RNA提取試劑TRIzolRReagent、platinumRpfx DNA聚合酶、SuperscriptTMⅡ反轉(zhuǎn)錄酶、platinum R pfx DNA聚合酶、RNaseH(RNA酶H)、RNase OUT RNA酶抑制劑、TRIzol R Reagent和脂質(zhì)體DMRIE-C和脂質(zhì)體lipofectamine 2000均購(gòu)自Invitrogen公司；DNA Marker及LA PCRTMKit Ver.2.1均購(gòu)自TaKaRa公司；限制性?xún)?nèi)切酶及T4DNA連接酶均購(gòu)自NEB公司；DNA純化試劑盒E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit和質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖蠩.Z.N.A.TMPlasmid M ini Kit購(gòu)自O(shè)mega公司；Clone JET PCR Cloning Kit購(gòu)自Fermentas公司；Opti-MEM I無(wú)血清培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；抗美洲型PRRSV M蛋白的單克隆抗體(MAb)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所惠贈(zèng)。

表1 設(shè)計(jì)引物用以改造A1片段Table 1Primer design for fragment A1reconstruction

1.5 pOK-Aa、pOK-Ab、pOK-Ac質(zhì)粒的構(gòu)建基因缺失片段A1a、A1b及A1c上下游片段的擴(kuò)增，回收后進(jìn)行融合PCR擴(kuò)增，回收純化產(chǎn)物與pJET 1.2Blunt Vector載體進(jìn)行連接，測(cè)序正確后從菌液提取重組質(zhì)粒，將雙酶切后回收純化的產(chǎn)物A1a、A1b、A1c基因片段與A2及pOKq進(jìn)行連接，使用NEB T4DNA連接酶對(duì)得到的雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化，測(cè)序鑒定。

1.6 Nsp2部分缺失全長(zhǎng)質(zhì)粒的構(gòu)建 用限制性?xún)?nèi)切酶 NotⅠ和 AflⅡ?qū)?pOK-Aa、pOK-Ab、pOK-Ac及pOK-BCD進(jìn)行酶切，將雙酶切后回收純化的產(chǎn)物Aa、Ab、Ac基因片段分別與同樣酶切處理的pOK-BCD進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物進(jìn)行NotⅠ-HFTM單酶切鑒定，并分別將構(gòu)建的感染性克隆轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞進(jìn)行病毒拯救[8]。

1.7 拯救病毒的穩(wěn)定性分析及RT-PCR鑒定 將拯救病毒連續(xù)在Marc-145細(xì)胞中傳至12代，并對(duì)1、3、6、9、12代進(jìn)行TCID50測(cè)定。通過(guò)設(shè)計(jì)與合成鑒別引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增測(cè)序鑒定。鑒別引物：F：5'-GTTCCTGAGCTTGGGGTGCT-3'； R： 5'-CGAAT TTCTTTGTACTGAAC-3'

1.8 間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)檢測(cè) 利用BHK-21細(xì)胞轉(zhuǎn)染后上清接種Marc-145細(xì)胞按常規(guī)方法進(jìn)行IFA檢測(cè)，一抗為美洲型MAb M蛋白1∶100倍稀釋?zhuān)篂?∶1000稀釋FITC標(biāo)記的羊抗鼠抗體，同時(shí)設(shè)正常的細(xì)胞作空白對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 A1a、A1b、A1c上下游片段的擴(kuò)增、融合及測(cè)序結(jié)果 以質(zhì)粒pJET-CMV-A1為模板，采用上述6對(duì)引物分別對(duì)A1a、A1b、A1c基因片段的上下游進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別得到目的片段長(zhǎng)度分別約為 ：A1a， 2800bp、 720bp、 3500bp(圖 2A)；A1b 2800bp、1000bp、3800bp(圖 2B)；A1c，3100bp、720bp、3900bp(圖2C)，均與預(yù)期大小相符，測(cè)序結(jié)果顯示與設(shè)計(jì)缺失位點(diǎn)一致。

2.2 pOK-Aa、pOK-Ab、pOK-Ac重組質(zhì)粒的構(gòu)建 將重組質(zhì)粒pJET-A1a、pJET-A1b、pJET-A1c分別用NotⅠ-HFTM、XhoⅠ進(jìn)行雙酶切后得到大約為2800bp的pJET1.2/blunt載體片段和約3500bp的A1a片段、約3800bp的A1b和A1c片段，與預(yù)期大小相符，將pJET-A2進(jìn)行XhoⅠ/AflⅡ雙酶切，得到約為2800bp的pJET 1.2/blunt載體片段和3100bp的A2目的片段，與預(yù)期大小相符，鑒定為陽(yáng)性的菌液由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確的重組質(zhì)粒分別命名為pOK-Aa、pOK-Ab、pOK-Ac。

2.3 Nsp2部分缺失全長(zhǎng)cDNA質(zhì)粒的構(gòu)建 將重組質(zhì)粒pOK-BCD用NotⅠ-HFTM、AflⅡ進(jìn)行雙酶切，得到約為11kb的BCD片段，與預(yù)期大小相符(圖3a)。將重組質(zhì)粒pOK-Ab用NotⅠ-HFTM、AflⅡ進(jìn)行雙酶切，獲得約為7000bp的Ab與大約1800bp的pOK載體片段，與預(yù)期大小相符(圖3b)。將二者連接轉(zhuǎn)化后抽提質(zhì)粒，通過(guò)NotⅠ-HFTM進(jìn)行單酶切，得到約為18kb的目的片段，與預(yù)期大小相符(圖3c)。同時(shí)，鑒定為陽(yáng)性的菌液由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確的重組質(zhì)粒分別命名為pOK-AaBCD、pOK-AbBCD和pOKAcBCD。

2.4 轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清接種Marc-145細(xì)胞的病變結(jié)果將構(gòu)建的PRRSV XH-GD株Nsp2部分缺失的全長(zhǎng)cDNA質(zhì)?？寺OK-AbBCD轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞3d后收取細(xì)胞上清，離心后分別接種Marc-145細(xì)胞。其中，pOK-AbBCD的轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清接種Marc-145細(xì)胞72h后開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞病變(CPE)。而pOKAaBCD、pOK-AcBCD及正常細(xì)胞對(duì)照組均無(wú)CPE，親本病毒株出現(xiàn)明顯的CPE，將該拯救病毒命名為XH-GD-Δ105。

2.5 XH-GD-Δ105的穩(wěn)定性及與親本毒TCID50比較 取XH-GD-Δ105和未缺失拯救病毒及親本毒接種Marc-145細(xì)胞進(jìn)行體外傳代，對(duì)1代、3代、6代、9代、12代細(xì)胞病毒液進(jìn)行TCID50測(cè)定，親本病毒、未缺失拯救毒和XH-GD-Δ105病毒滴度比較情況如圖4，XH-GD-Δ105病毒滴度明顯低于親本毒及未缺失拯救毒，而后兩者幾乎保持一致。

2.7 拯救病毒的IFA鑒定 親本病毒和拯救病毒分別接種Marc-145細(xì)胞進(jìn)行IFA檢測(cè)。結(jié)果顯示，接種XH-GD-Δ105第一代及親本毒PRRSV XH-GD的細(xì)胞可被M蛋白MAb所識(shí)別，有特異性的熒光產(chǎn)生，而對(duì)照組細(xì)胞未見(jiàn)熒光(圖6)。

2.6 拯救病毒的RT-PCR鑒定 利用鑒別引物對(duì)在Marc-145細(xì)胞中3代、6代、9代、12代的拯救病毒進(jìn)行鑒定，并設(shè)親本病毒株XH-GD做陽(yáng)性對(duì)照。拯救病毒及親本病毒擴(kuò)增片段分別約為750bp，與預(yù)期大小相符。與親本病毒XH-GD相比，拯救病毒的3代、6代、9代、12代在510位核苷酸位點(diǎn)突變與沉默突變?cè)O(shè)計(jì)相符，該位點(diǎn)突變后引入酶切位點(diǎn)FseⅠ(GGCCGGCC)，與預(yù)期結(jié)果一致。利用限制性?xún)?nèi)切酶FseⅠ對(duì)拯救病毒的第12代進(jìn)行酶切鑒定(圖5)，可見(jiàn)約540bp和200bp的目的片段，與預(yù)期結(jié)果一致。

3 討 論

Nsp2是PRRSV中變異性最高并且最具有免疫原性的多結(jié)構(gòu)域蛋白[9]，目前已鑒定Nsp2至少具有4個(gè)功能區(qū)[10]。Nsp2中間的高變區(qū)具有耐受插入、缺失、突變的能力。同時(shí)，Nsp2具有多個(gè)抗原表位[11]。本研究PRRSV Nsp2缺失位置為320位～530位，該位置包括自然缺失的第481及29個(gè)氨基酸自然缺失前的部分區(qū)域，并且包括了385D～D394，452P～S466，467P～S477等3處抗原表位，為了解PRRSV在自然缺失后能否在缺失前位置發(fā)生進(jìn)一步的缺失，以及在缺失多個(gè)抗原表位后其生長(zhǎng)特性及免疫原性的變化，進(jìn)行了該區(qū)域的缺失研究。

由于本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的PRRSV XH-GD株Nsp2部分缺失的感染性克隆能夠在體外Marc-145細(xì)胞中復(fù)制，拯救毒XH-GD-Δ105在Marc-145細(xì)胞中能夠穩(wěn)定傳代，表明了Nsp2的320位～424位氨基酸處存在缺失對(duì)于PRRSV XH-GD的復(fù)制是非必需的，不會(huì)影響其體外的增殖。同時(shí)其病毒滴度明顯低于親本株，表明該缺失區(qū)域?qū)τ诓《镜亩玖赡艽嬖谝欢ㄓ绊懀欢鳱sp2編碼區(qū)這105個(gè)氨基酸的缺失是否會(huì)對(duì)親本株毒力造成影響，還需要后續(xù)進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步研究。由于本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的pOKAaBCD是在Nsp2的321位～530位氨基酸處存在缺失，覆蓋了pOK-AbBCD的Nsp2編碼區(qū)缺失的320位～424位氨基酸位點(diǎn)及pOK-AcBCD的Nsp2編碼區(qū)缺失的435位～530位氨基酸位點(diǎn)，而實(shí)驗(yàn)中pOK-AaBCD及pOK-AcBCD這兩個(gè)全長(zhǎng)重組質(zhì)粒沒(méi)有拯救出來(lái)，與Han等針對(duì)VR2332株Nsp2進(jìn)行不同部位的缺失，發(fā)現(xiàn)在324位～523位，324位～726位等處缺失能夠拯救出病毒的結(jié)果不一致[12]，這可能是由于存在病毒株特異性。另外，本研究中缺失位點(diǎn)從320位開(kāi)始，相比VR2332缺失來(lái)說(shuō)本研究缺失位置更接近保守區(qū)序列，因此可能與所設(shè)計(jì)的pOK-AcBCD的Nsp2編碼區(qū)缺失的435位～530位氨基酸位點(diǎn)和高變區(qū)前保守序列共同影響有關(guān)，該缺失區(qū)域及前列保守區(qū)是否含有與病毒復(fù)制相關(guān)的必需因子還有待于進(jìn)一步研究。

本研究構(gòu)建基于親本病毒株P(guān)RRSV XH-GD的3個(gè)Nsp2部分缺失的全長(zhǎng)cDNA質(zhì)粒，分別命名為pOK-AaBCD、pOK-AbBCD和 pOK-AcBCD，由于XH-GD-Δ105在Nsp2編碼區(qū)的320位～424位氨基酸存在缺失，但這一缺失區(qū)域并沒(méi)有影響到病毒的復(fù)制，表明這一區(qū)域?qū)Σ《镜膹?fù)制是非必需的。

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