甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子在宣威肺腺癌中的表達(dá)及臨床意義

俎云芬 王熙才 劉馨 陳艷 李承文 尚學(xué)琴 謝余澄 趙虹園 王繼營

肺癌是最常見的惡性腫瘤，死亡率居全世界腫瘤死亡之首[1]，80%以上為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC），其中肺腺癌發(fā)病率逐漸增加，占NSCLC的50%，成為最常見的組織學(xué)類型。云南宣威肺癌以女性腺癌為主，其特點(diǎn)為女性發(fā)病率高，死亡高峰年齡提前，室內(nèi)污染及人群遺傳易感性是主要發(fā)病原因[2]。進(jìn)一步探索宣威肺癌組織生物學(xué)行為和臨床特征，判斷預(yù)后一直是人們關(guān)注焦點(diǎn)。

甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子（thyroid transcription factor 1,TTF-1）在II型肺泡細(xì)胞和細(xì)支氣管上皮細(xì)胞中表達(dá)，并且60%-80%的肺腺癌亦表達(dá)TTF-1[3-5]。研究表明，TTF-1的表達(dá)與肺腺癌患者預(yù)后有密切相關(guān)。本文通過實時定量PCR及免疫組織化學(xué)方法檢測TTF-1在XWLC-05中的mRNA及蛋白表達(dá)情況及與Ki-67的關(guān)系，觀察二者在宣威肺腺癌組織中表達(dá)的相關(guān)性和對預(yù)后的影響，旨在評價TTF-1在宣威肺癌的臨床應(yīng)用價值以及對預(yù)后影響。

1 材料與方法

1.1 肺癌細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng) 選取H157細(xì)胞株（鱗癌，不表達(dá)TTF-1 mRNA）和細(xì)胞株MGH24（腺癌，高表達(dá)TTF-1 mRNA）[6]作為對照，檢測細(xì)胞株XWLC-05 TTF-1 mRNA表達(dá)，XWLC-05[7]來源于一宣威女性，右肺中分化腺癌術(shù)后標(biāo)本，經(jīng)過原代和傳代培養(yǎng)，生長穩(wěn)定，裸鼠成瘤率高。H157、XWLC-05及MGH24三株細(xì)胞均來自云南省腫瘤研究所。于5%CO2、37oC、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代，以RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%小牛血清）培養(yǎng)，0.25%胰酶-EDTA消化傳代。

1.2 qRT-PCR檢測XWLC-05TTF-1 mRNA的表達(dá) 取對數(shù)生長期的細(xì)胞（H157、XWLC-05及MGH24）用Trizol法提取各組總RNA，核酸蛋白檢測儀檢測RNA純度，RNA電泳檢測RNA完整性。按照cDNA試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。TTF-1上游引物序列：5'-GAGGGAGGAGCAGCCCC-3'，下游引物序列：5'-CCACTTTCTTGTAGCTTTCCTCCA-3'以β-actin為內(nèi)參，上游引物序列：5'-ACATCTGCTGGAAGGTGG AC-3' ，下游引物序列：5'-GGTACCACCATGTACCCA GG-3'。按SYBGreen試劑盒（Bio-Rad公司）說明書進(jìn)行擴(kuò)增，90oC變性10 min后，按下述條件擴(kuò)增40個循環(huán)：95oC、30 s，60oC、60 s，循環(huán)40次。mRNA相對表達(dá)量=2-△△Ct，其中-△Ct=（目的基因的平均Ct值-內(nèi)參基因的平均Ct值）。

1.3 XWLC-05 細(xì)胞免疫組化檢測 鼠抗人TTF-1單克隆抗體、兔抗人Ki-67單克隆抗體、免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，使用即用型（MaxvisionTM2/HRP免疫組化染色，步驟按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。細(xì)胞經(jīng)過冰丙酮固定，抗體孵育，DAB顯色。在鏡下觀察陽性細(xì)胞比例。

1.4 標(biāo)本收集 昆明醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院2008年1月-2012年3月手術(shù)切除原發(fā)性宣威肺癌組織標(biāo)本96例，所有病例均為病理切片HE染色確診的原發(fā)性肺腺癌。采集病例相關(guān)的臨床病理資料，包括年齡、性別、吸煙史、分化程度及TNM分期；病理類型根據(jù)2004年WHO肺、胸膜腫瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)；腫瘤分期按2002年國際抗癌聯(lián)盟TNM分期標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 宣威肺癌病例免疫組化檢測 96例宣威肺腺癌的病例經(jīng)再次核對組織病理學(xué)診斷。免疫組化SP法檢測，主要試劑鼠抗人TTF-1、兔抗人Ki-67單克隆抗體及免疫組化試劑盒均為福州邁新公司產(chǎn)品。切片經(jīng)常規(guī)脫蠟，用3%過氧化氫去除內(nèi)源性過氧化物酶，高溫抗原修復(fù)。免疫組化染色方法和步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。分別用PBS代替一抗作空白對照，已知陽性（細(xì)支氣管肺泡癌）切片做陽性對照。每張切片高倍鏡下隨機(jī)選取10個視野共記錄1,000個細(xì)胞，使用半定量法計算TTF-1及Ki-67細(xì)胞核染數(shù)目百分比：0；（+）為＜25%；（++）為26%-50%；（+++）為＞50%。

1.6 隨訪和生存分析 末次隨訪時間為2012年9月1日。無進(jìn)展生存期（progression-free survival, PFS）：首次治療開始至腫瘤復(fù)發(fā)或進(jìn)展的時間，最短隨訪時間為4個月，最長隨訪時間為4年，有6例失訪。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，Wilcoxon秩和檢驗和Spearman等級相關(guān)分析TTF-1及Ki-67陽性率，TTF-1與Ki-67表達(dá)相關(guān)性，應(yīng)用Kaplan-Meier法（組間生存率比較采用Log-rank檢驗）進(jìn)行生存分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖 1 逆轉(zhuǎn)錄實時定量PCR檢測3個非小細(xì)胞肺癌株mRNA表達(dá)Fig 1 The reverse transcription and real-time PCR analysis of mRNA transcript levels in 3 non-small cell lung cancer (NSCLC) cell lines

圖 2 免疫組化分析TTF-1及Ki-67在XWLC細(xì)胞中表達(dá)。A：XWCL-05 (HE染，×200)，B：TTF-1（-） (IHC，×200)，C：Ki-67（+++）(IHC，×200)。Fig 2 Immunohistochemistry for TTF-1 and Ki-67 in Xuanwei lung adenocarcinomas line XWCL-05. A: XWCL-05 (HE, ×200); B: TTF-1(-)(IHC, ×200); C: Ki-67(+++)(IHC, ×200).

2 結(jié)果

2.1 TTF-1 mRNA在XWCL-05細(xì)胞系中表達(dá) 在3株細(xì)胞中已知H157不表達(dá)，而MGH24高表達(dá)TTF-1，XWLC-05 TTF-1 mRNA的表達(dá)水平與H157比較為0.55，MGH24為1.3，顯示XWCL-05低表達(dá)TTF-1（圖1）。

2.2 免疫組化分析TTF-1及Ki-67在XWLC-05中蛋白表達(dá)TTF-1在XWLC-05中表達(dá)陰性，Ki-67為100%表達(dá)（圖2）。

2.3 臨床病例資料 96例宣威肺腺癌患者，其中男性43例，女性53例；平均年齡男性54歲，女性51歲；不吸煙47例，吸煙49例；高分化39例，中低分化57例；I期+II期63例，III期33例。統(tǒng)計學(xué)結(jié)果顯示，TTF-1陽性表達(dá)程度隨腫瘤分化程度的增加而增高（P=0.002），而與性別、年齡、吸煙等無關(guān)（P＞0.05）（表1，圖3）。

2.4 TTF-1和Ki-67在宣威肺癌相關(guān)性分析 經(jīng)過Spearman等級相關(guān)分析，在96例肺癌組織中TTF-1和Ki-67的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P=0.01）（表2）。

2.5 生存分析 Kaplan-Meier生存曲線顯示，TTF-1強(qiáng)陽性組的中位PFS與陰性和弱陽性組比較有統(tǒng)計學(xué)意義（45個月 vs 35個月，P=0.036）（圖4A），I期-II期組與III期組中位PFS比較有統(tǒng)計學(xué)意義（46個月 vs 32個月，P=0.001）（圖4B），Ki-67陰性和弱陽性組中位PFS與強(qiáng)陽性組比較有統(tǒng)計學(xué)意義（46個月 vs 40個月，P=0.048）（圖4C），患者中位PFS與性別、年齡、吸煙及腫瘤分化程度無關(guān)。

圖 3 免疫組化檢測宣威肺腺癌TTF-1和Ki-67的蛋白表達(dá)。A：TTF-1在高分化腺癌表達(dá)（+++）（IHC，×100）；B：TTF-1在低分化腺癌表達(dá)（+）（IHC，×100）；C：Ki-67在低分化腺癌表達(dá)（++）（IHC，×100）；D：Ki-67在高分化腺癌表達(dá)（+）（IHC，×100）。Fig 3 The TTF-1 and Ki-67 proteins are detected by immunohistochemistry.

圖 4 不同因素組96例宣威肺癌患者的中位無進(jìn)展生存曲線。 A：TTF-1強(qiáng)度；B：分期；C：Ki-67強(qiáng)度。Fig 4 Median PFS curves of different variables of 96 patients with Xuanwei lung adenocarcinoma. A: TTF-1; B: stages; C:Ki-67.

表 1 TTF-1和Ki-67蛋白表達(dá)與宣威肺腺癌的臨床資料相關(guān)性Tab 1 Correlations between TTF-1 and KI-67 expressions and clinicopathological features in Xuanwei lung adenocarcinomas

表 2 宣威肺腺癌中TTF-1與Ki-67的相關(guān)性Tab 2 Correlation between TTF-1 expression and Ki-67 proliferative activity in Xuanwei lung adenocarcinomas

3 討論

TTF-1是核轉(zhuǎn)錄蛋白NKx2基因家族成員之一，是常染色體14q13單一位點(diǎn)基因編碼的產(chǎn)物，分子量38 kDa，參與調(diào)控許多基因的表達(dá)。TTF-1在肺組織形成早期階段就開始并且終身表達(dá)。動物實驗[8]表明，TTF-1基因被敲除后，導(dǎo)致肺發(fā)育不全，鼠死于呼吸衰竭，TTF-1對肺組織的形成和分化及保持肺的末端呼吸單位功能具有十分重要的作用。在NSCLC組織中，60%-80%的肺腺癌，0-27%的肺鱗癌及0-25%的大細(xì)胞癌表達(dá)TTF-1，以此鑒別肺腺癌和其它類型的NSCLC或者原發(fā)性肺腺癌和轉(zhuǎn)移性肺腺癌。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)TTF-1的表達(dá)與患者的預(yù)后密切相關(guān)，TTF-1在肺腺癌的形成中所起的作用及其作用機(jī)理不清楚，且存在爭議。

Winslow等[9]應(yīng)用基因重組慢病毒載體構(gòu)建鼠肺腺癌模型，構(gòu)建了原發(fā)性肺腺癌無轉(zhuǎn)移（TnonMet)、原發(fā)性肺腺癌有轉(zhuǎn)移（Tmet）、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（Met）的細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)在TMet和Met中缺乏TTF-1的mRNA及蛋白表達(dá)，低分化腺癌TTF-1低表達(dá)，而高分化中持續(xù)表達(dá)。本研究提示：93%宣威肺腺癌患者表達(dá)TTF-1，表達(dá)強(qiáng)度隨著腫瘤分化程度增高而增高，高分化腺癌高表達(dá)TTF-1，與Ki-67表達(dá)負(fù)相關(guān)，兩者均具有統(tǒng)計學(xué)意義，與張鵬等[10]研究一致。Fujita等[11]和Zu等[6]顯示TTF-1 mRNA在NSCLC系表達(dá)頻率低，包括腺癌細(xì)胞分別為50%及25%，人類肺腺癌組織多達(dá)80%有TTF-1蛋白表達(dá)，本研究宣威肺腺癌細(xì)胞株TTF-1 mRNA低表達(dá)，蛋白表達(dá)陰性，Ki-67表達(dá)100%陽性，說明肺癌細(xì)胞系細(xì)胞增殖旺盛，增殖率高，所以缺乏TTF-1的表達(dá)。

一項meta分析[12]顯示TTF-1在NSCLC中高表達(dá)與患者預(yù)后好密切相關(guān)，特別是在早期或者局部晚期的腺癌。Tan等[13]報道一組126例NSCLC患者中TTF-1陽性表達(dá)者中位生存期超過53.2個月，而陰性表達(dá)者僅為39.4個月。本研究將96例宣威肺腺癌分為兩組，TTF-1強(qiáng)陽性組與弱陽性和陰性組對比，中位生存有所延長（45個月 vs 35個月），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Solis等[14]在肺腺癌亞組非實性腺癌組得出同樣結(jié)論。劉標(biāo)等[15]最新研究顯示TTF-1高表達(dá)的貼壁為主型、乳頭為主型和微乳頭為主型腺癌中可能存在EGFR突變；而TTF-1陰性的浸潤性黏液腺癌和膠樣腺癌則可能存在Kras突變。Chung等[16]對496例進(jìn)展期肺腺癌患者TTF-1的蛋白表達(dá)及EGFR突變分析，443例TTF-1陽性表達(dá)，TTF-1陽性與陰性患者比較總生存27.4個月 vs 11.8個月，在EGFR突變患者中，TTF-1陽性與陰性患者比較無進(jìn)展生存8.7個月 vs 5.7個月，均有統(tǒng)計學(xué)意義，提示TTF-1在肺癌發(fā)生發(fā)展過程中可能起到重要作用，其表達(dá)的缺失引起腫瘤侵襲性增強(qiáng)，從而影響患者預(yù)后。然而，Yoon等[17]在79例手術(shù)的NSCLC肺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞中檢測TTF-1 mRNA表達(dá)發(fā)現(xiàn)術(shù)后TTF-1陽性的患者無進(jìn)展生存明顯縮短，Weir等[18]在528例凍存肺腺癌標(biāo)本中提取DNA進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性分析顯示：TTF-1在肺腺癌中是最常見的擴(kuò)增子之一。這些相互矛盾的結(jié)果說明，TTF-1也許在腫瘤不同發(fā)展階段發(fā)揮不同的作用[9]，主要與它的結(jié)構(gòu)有關(guān)，羥基末端及羧基末端位于兩端，DNA-結(jié)合同源結(jié)構(gòu)域居中央，兩端分別與多個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，TTF-1與這些轉(zhuǎn)錄因子相互作用，并參與了多個肺癌基因的調(diào)控，能夠起協(xié)同或拮抗作用，促進(jìn)或抑制肺癌生長和轉(zhuǎn)移。本研究樣本量少，需要進(jìn)一步在宣威肺腺癌中擴(kuò)大樣本研究。

綜上所述，TTF-1在宣威肺腺癌中可能是一個腫瘤抑制基因，TTF-1的表達(dá)與病理分化程度有關(guān)，隨著病理分化程度的增高而增強(qiáng)，與Ki-67表達(dá)負(fù)相關(guān)，并且可作為宣威肺腺癌患者預(yù)后好的指標(biāo)。