重組人血管內(nèi)皮抑制素聯(lián)合貝伐珠單抗體內(nèi)抑瘤作用的效果及分析

牛牛 李寶蘭 劉朝陽(yáng) 胡瑛 李雪冰 李杰 史鶴齡 張海清

自20世紀(jì)70年代Folkman教授[1]提出腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于腫瘤內(nèi)部新生血管的觀點(diǎn)后，很多研究一直致力于通過(guò)阻斷腫瘤新生血管形成來(lái)達(dá)到治療腫瘤的目的?？寡苤委熃陙?lái)隨著靶向治療在腫瘤治療領(lǐng)域的方興未艾，越來(lái)越成為臨床治療腫瘤的重要受手段之一。肺癌則是世界上對(duì)人類健康威脅最大的一種常見(jiàn)腫瘤，目前世界上每年大約新發(fā)肺癌病例約160萬(wàn)人[2]，而肺癌的治療效果目前仍然很不理想，據(jù)報(bào)道，美國(guó)每年因肺癌死亡人口超過(guò)16萬(wàn)[3]。近年來(lái)隨著靶向藥物和抗血管治療藥物進(jìn)入臨床，延長(zhǎng)了肺癌特別是中晚期肺癌患者的生存期。目前在國(guó)內(nèi)外最常見(jiàn)的腫瘤抗血管治療藥物就是貝伐珠單抗和重組人血管內(nèi)皮抑制素（及其改良制劑）。兩種藥物作用機(jī)制各異，雖然有很多體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)都證明兩種藥物有明確的抗腫瘤作用，但是目前尚缺乏在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃蜅l件下，對(duì)兩種藥物實(shí)際作用效果的分析的實(shí)驗(yàn)。我們也注意到在國(guó)內(nèi)外的多中心臨床研究中抗血管治療只使用一種藥物，雖然研究結(jié)果證明抗血管治療可以延長(zhǎng)患者的生存期，但是作用還很有限[4]。本實(shí)驗(yàn)第一次在同一試驗(yàn)?zāi)Ｐ拖卤容^重組人血管內(nèi)皮抑制素和貝伐珠單抗在體內(nèi)實(shí)際的抗腫瘤效果。同時(shí)第一次聯(lián)合使用兩種抗血管藥物，分析有無(wú)聯(lián)合用藥的可能性，探索將來(lái)腫瘤臨床抗血管治療的新方法和新思路。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 主要藥物及實(shí)驗(yàn)材料 重組人血管內(nèi)皮抑制素注射液（恩度，Endostar），購(gòu)自山東先聲麥得津生物制藥有限公司。貝伐珠單抗注射液（安維汀，Avastin），購(gòu)自上海羅氏制藥有限公司。RIPA蛋白抽提試劑盒及BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自北京賽馳生物科技公司。VEGF兔抗人單克隆抗體（IgG VEGF-A、IgG VEGF-C）抗體購(gòu)自北京新新通生物科技公司。凝膠分析系統(tǒng)采用復(fù)日Smart View生物電泳圖像分析系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：Balb/c裸鼠（16 g-18 g，SPF級(jí)）中國(guó)藥品生物制品檢定所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)SCXK（京）2009-0017）。人肺腺癌A549細(xì)胞株，由D.J. Giard等建株，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 體外細(xì)胞培養(yǎng) A549細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/m L青霉素、100 U/m L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置37oC、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2天傳代一次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 取經(jīng)體外細(xì)胞培養(yǎng)已在裸鼠皮下傳代生長(zhǎng)良好的移植性肺腺癌腫瘤結(jié)節(jié)，無(wú)菌操作制成瘤細(xì)胞小塊，用穿刺針接種于Balb/c裸鼠腋窩皮下，1塊/鼠（約2 mm3）。將動(dòng)物隨機(jī)分為4組，每組6只，稱體重標(biāo)號(hào)。4組分別為模型對(duì)照組（control group, CG）、重組人血管內(nèi)皮抑制素（3 mg/kg）組（Endostatin group, EG）、貝伐珠單抗（5 mg/kg）（Bevacizumab group, BG）組、重組人血管內(nèi)皮抑制素（3 mg/kg）聯(lián)合貝伐珠單抗（5 mg/kg）（combining group, COG）組。各組在接種腫瘤后第15日開(kāi)始皮下瘤周給藥，重組人血管內(nèi)皮抑制素每天1次，連續(xù)16天，共16次。貝伐珠單抗每周2次（周一、周二給藥），共6次。模型對(duì)照組使用0.9%無(wú)菌氯化鈉液（5 m L/kg）每日瘤周注射，共16次。重組人血管內(nèi)皮抑制素（3 mg/kg）、 貝伐珠單抗（5 mg/kg）聯(lián)合用組給藥方式同單獨(dú)給藥組。裸鼠飼養(yǎng)室擁有IVC-II型（智能型）獨(dú)立送風(fēng)隔離籠具，室溫20oC-22oC，相對(duì)濕度40%-60%（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(京)2008-0025）。裸鼠食用滅菌裸鼠飼料，SPF級(jí)，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所產(chǎn)品（許可證號(hào)SCXK(京)2009-0008），執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)GB14924.3-2001。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后每4天用卡尺測(cè)一次皮下腫瘤體積，每次給藥結(jié)束后觀察荷瘤鼠表現(xiàn)，于腫瘤接種后第31天處死動(dòng)物，完整剖取瘤結(jié)并稱瘤重和體重，計(jì)算相對(duì)腫瘤增殖率。

1.2.3 Western blot實(shí)驗(yàn) 將腫瘤標(biāo)本用含有蛋白酶抑制劑的RIPA蛋白抽提試劑盒裂解，而后于冰上孵育20 m in，4oC離心（13,000 rpm, 20 m in）。離心完成后取上清經(jīng)BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測(cè)定。10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，然后轉(zhuǎn)至固相載體（NC膜）上。10%牛奶封閉非特異抗原，加入一抗（兔抗人VEGF-A/C單克隆抗體）4oC反應(yīng)過(guò)夜，常溫洗膜后加入二抗，室溫反應(yīng)1 h。用Pierce公司的Supersignal West Dura Extended Duration Substrate ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，將A液與B液等體積混合，配成發(fā)光劑，滴在保鮮膜上，將NC膜倒扣于其上，5 min后用另一保鮮膜將NC膜包裹，X線片壓片，曝光20 s-5 min，顯影2 min，定影2 min。Western blot結(jié)果掃描儲(chǔ)存。 用復(fù)日Smart View生物電泳圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.2.4 藥效判定標(biāo)準(zhǔn)：

腫瘤體積（V）= 腫瘤長(zhǎng)徑（L）×腫瘤短徑（S）2/2

按以下公式計(jì)算相對(duì)腫瘤體積（RTV）和相對(duì)腫瘤增殖率T/C%：RTV=Vt/V0

Vt：測(cè)量腫瘤得到的瘤體積

V0：初始瘤體積（給藥前）

T/C%=給藥組的RTV平均值/對(duì)照組的RTV平均值×100%

公式中EA為A藥抑瘤率，EB為B藥抑瘤率，EAB為兩藥合用抑瘤率，q=0.85-1.15為兩藥合用作用相加，q＞1.15為兩藥合用作用增強(qiáng)，q＜0.85為兩藥合用作用拮抗[5]。

Western blot結(jié)果分析：采用凝膠圖像分析系統(tǒng)，對(duì)電泳條帶進(jìn)行密度掃描后進(jìn)行灰度分析（Smart View生物電泳圖像分析系統(tǒng)）。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)方法 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)處理均采用SPSS 13.0軟件系統(tǒng)處理，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果所有數(shù)據(jù)以Mean±SD表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)共計(jì)31天，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)重組人血管內(nèi)皮抑制素（3 mg/kg）聯(lián)合貝伐珠單抗（5 mg/kg）組抑瘤率為64.15%，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），重組人血管內(nèi)皮抑制素單藥組（3 m g/kg）抑瘤率為38.68%，貝伐珠單抗單藥組（5 mg/kg）抑瘤率為52.36%。重組人血管內(nèi)皮抑制素、貝伐珠單抗聯(lián)合用藥Q值為0.906，提示兩藥聯(lián)合使用作用相加。實(shí)驗(yàn)結(jié)束，各治療組動(dòng)物與對(duì)照組比較，體重?zé)o明顯差異，動(dòng)物活動(dòng)正常未表現(xiàn)毒性反應(yīng)。表1顯示各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基本情況和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。給藥期間腫瘤生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖1。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)各組瘤重圖見(jiàn)圖2。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的腫瘤組織瘤結(jié)照片見(jiàn)圖3。

2.2 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果 對(duì)Western blot電泳結(jié)果分析：貝伐珠單抗組VEGF-A表達(dá)較對(duì)照組明顯減少，抑制率為60.8%。重組人血管內(nèi)皮抑制素組VEGF-A（圖4）、VEGF-C（圖5）表達(dá)較對(duì)照組亦有減少，抑制率分別為14.6%、30.3%。重組人血管內(nèi)皮抑制素聯(lián)合貝伐珠單抗組VEGF-A、VEGF-C表達(dá)較對(duì)照組抑制最為顯著，抑制率為79.7%、44.2%。β-Actin表達(dá)在各組中無(wú)明顯差異。

圖 1 各組間腫瘤體積生長(zhǎng)情況分析(棕色曲線：對(duì)照組平均種瘤體積（347.27±3.51）mm 3；紅色曲線：重組人血管內(nèi)皮抑制素治療（198.29±2.13）mm 3；綠色曲線：貝伐珠單抗治療組（143.57±2.82）mm 3；藍(lán)色曲線：聯(lián)合用藥組（117.63±1.93）mm 3。各組較對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.01)。Fig 1 Tum o r su rv iva l tim e a fte r adm in istra tion o f end ostatin o r com bined w ith bevacizum ab on nude m ice bearing A549. Brow n line:con tro l g roup: (347.27±3.51) mm 3; Red line: endostatin g roup: (198.29±2.13) mm 3; Green line: bevacizum ab g roup: (143.57±2.82) mm 3; b lue line: com b in ing g roup: (117.63±1.93) mm 3. Com pared w ith con tro l g roup, P＜0.01).

圖 2 各組間抑瘤效果分析。黑色柱：對(duì)照組腫瘤平均重量（0.35±0.06）g；紅色柱：重組人血管內(nèi)皮抑制素治療組腫瘤平均重量（0.22±0.10）g，抑瘤率：38.68%；綠色柱：貝伐珠單抗治療組腫瘤平均重量（0.17±0.07）g，抑瘤率：52.36%；藍(lán)色柱：聯(lián)合治療組腫瘤平均重量（0.13±0.07）g，抑瘤率：64.15%。各組較對(duì)照組相比均有顯著差異，P＜0.01）。Fig 2 Inh ib itive effect o f endostatin com b ined w ith bevacizum ab on nude m ice bearing A549. Black co lum n: con tro l g roup, TW: (0.35±0.06) g; Red co lum n: endostatin co lum n, TW: (0.22±0.10) g, TIR:38.68%; Green co lum n: bevacizum ab co lum n, TW: (0.17±0.07) g,TIR: 52.36%; Blue co lum n: com b ining g roup, TW: (0.13±0.07) g, TIR:64.15%. Com pared w ith con tro l g roup, P＜0.01).

表 1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基本情況Tab 1 Basic in form ation about the experim ent

圖 3 瘤體切除后照片F(xiàn)ig 3 Ph o to g rap h o f En d o sta tin com b in ed w ith bevacizum ab on nude m ice bearing transp lanted tum or A549

圖 4 Western b lo t檢測(cè)各組中VEGF-A蛋白的表達(dá)。泳道1、2：對(duì)照組；泳道3、4：貝伐珠單抗組，抑制率60.8%；泳道5、6：重組人血管內(nèi)皮抑制素治療組，抑制率14.6%；泳道7、8：聯(lián)合治療組，抑制率79.7%。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用復(fù)日sm art view生物電泳圖像分析系統(tǒng)處理。Fig 4 Western b lo t analysis fo r VEGF-A p ro tein exp ression. Line 1, 2: con tro l group; Line 3, 4: bevacizum ab g roup/inhibition rate (IR): 60.8%; Line 5, 6:endostatin group/IR: 14.6%; Line 7, 8: com bining group/IR: 79.7%. All date w as analyzed by sm art view system and com pared w ith control group.

圖 5 Western b lot檢測(cè)各組中VEGF-C蛋白的表達(dá)。泳道1、2：對(duì)照組；泳道3、4：貝伐珠單抗組，較對(duì)照組無(wú)明顯改變；泳道5、6：重組人血管內(nèi)皮抑制素治療組抑制率30.3%；泳道7、8：聯(lián)合治療組，抑制率44.2%。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用復(fù)日Sm art View生物電泳圖像分析系統(tǒng)處理。Fig 5 Western b lo t analysis fo r VEGF-C p ro tein exp ression. Line 1, 2: con tro l g roup; Line 3, 4: bevacizum ab g roup, no d ifference w ith con tro l g roup; Line 5, 6: endostatin g roup/IR: 30.3%; Line 7, 8: com bining g roup/IR: 44.2%. All date w as analyzed by Sm art View system and com pared w ith contro l group.

3 討論

3.1 重組人血管內(nèi)皮抑制素和貝伐珠單抗的相互作用 通過(guò)實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)重組人血管內(nèi)皮抑制素和貝伐珠單抗在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均表現(xiàn)出了一定的抑制腫瘤生長(zhǎng)的能力，貝伐珠單抗抑制腫瘤生長(zhǎng)的能力更強(qiáng)（52.36% vs 38.68%）。聯(lián)合使用兩種藥物則效果更為明顯（64.15%）。貝伐珠單抗是一個(gè)作用機(jī)制明確的單克隆抗體藥物。其為一個(gè)人源化的VEGF單克隆IgG抗體，通過(guò)與循環(huán)VEGF-A結(jié)合，阻止其與內(nèi)皮細(xì)胞表面相應(yīng)的VEGF受體結(jié)合達(dá)到抗腫瘤新生血管之作用[6,7]。而重組人血管內(nèi)皮抑制素自1997年O' Reilly等[8]從小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞瘤的培養(yǎng)上清液中分離發(fā)現(xiàn)以后，雖然在眾多體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中均發(fā)現(xiàn)有明顯的抑制腫瘤新生血管形成的作用，但具體作用機(jī)制至今仍然未明確。Tan等[9]研究發(fā)現(xiàn)重組人血管內(nèi)皮抑制素處于腫瘤新生血管調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵部位，能夠下調(diào)多種促血管形成因子的表達(dá)如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子受體等，同時(shí)能上調(diào)多種抗腫瘤血管形成因子的表達(dá)，如血小板反應(yīng)蛋白1、酪氨酸蛋白激酶B3抗體等。Dhanabal等[10,11]研究發(fā)現(xiàn)重組人血管內(nèi)皮抑制素可能增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，改變血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞周期。Marko等[12]發(fā)現(xiàn)固定的重組人血管內(nèi)皮抑制素促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞存活，而可溶性的重組人血管內(nèi)皮抑制素則促進(jìn)其凋亡。Nicholas等[13]發(fā)現(xiàn)重組人血管內(nèi)皮抑制素可破壞肌球蛋白微絲結(jié)構(gòu)的完整性，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力下降。Kim等[14]研究發(fā)現(xiàn)重組人血管內(nèi)皮抑制素的部分抗腫瘤活性是通過(guò)調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶實(shí)現(xiàn)的，雖然相關(guān)研究很多，但目前尚難就重組人血管內(nèi)皮抑制素抑制腫瘤新生血管形成的確切機(jī)制達(dá)成共識(shí)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)重組人血管內(nèi)皮抑制素和貝伐珠單抗聯(lián)合使用，藥效上有相加作用（Q: 0.969），最近一些研究也表明重組人血管內(nèi)皮抑制素的部分抗血管生成作用也是通過(guò)影響VEGF表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。Huang等[15]發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子可促進(jìn)細(xì)胞核內(nèi)的核仁素遷徙到細(xì)胞表面，而用抗體封閉等技術(shù)，降低細(xì)胞表面表達(dá)的核仁素，可以明顯降低內(nèi)皮細(xì)胞的遷徙能力，防止新生脈管的形成。Song等[16]和Zhou等[17]都通過(guò)研究也發(fā)現(xiàn)核仁素也是重組人血管內(nèi)皮抑制素發(fā)揮抗腫瘤血管和淋巴管生成的重要受體。這些研究表明兩種藥物在作用機(jī)制上的確存在著交集。在本實(shí)驗(yàn)中兩者表現(xiàn)出作用相加效果，但其具體機(jī)制還需要更多的研究才能明確。

3.2 對(duì)淋巴管和血管的抑制作用 通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們可以看出在體內(nèi)貝伐珠單抗對(duì)VEGF-A的抑制作用明顯強(qiáng)于重組人血管內(nèi)皮抑制素（60.8% vs 14.6%），而重組人血管內(nèi)皮抑制素對(duì)VEGF-C則有一定的抑制作用（30.3%）。貝伐珠單抗相對(duì)于對(duì)照組沒(méi)有表現(xiàn)出對(duì)VEGF-C的抑制作用。這也與貝伐珠單抗是個(gè)單一的VEGF-A的單克隆抗體對(duì)VEGF-C沒(méi)有作用有關(guān)。眾所周知 VEGF-C于淋巴管的形成關(guān)系密切，而重組人血管內(nèi)皮抑制素對(duì)淋巴管的抑制作用，相關(guān)研究也有類似報(bào)道[18]。聯(lián)合用藥組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)無(wú)論是對(duì)于VEGF-A還是VEGF-C均表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抑制作用（79.4% vs 44.2%），這也與物實(shí)驗(yàn)中各組移植瘤抑瘤率的差異相吻合。我們發(fā)現(xiàn)雖然貝伐珠單抗本身對(duì)VEGF-C沒(méi)有直接作用，但是聯(lián)合使用后，聯(lián)合用藥組VEGF-C的抑制效果卻較單獨(dú)使用重組人血管內(nèi)皮抑制素更好，與之類似，Véronique Mathieu[19]發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤動(dòng)物模型中，聯(lián)合使用貝伐珠單抗和替莫唑胺能夠增強(qiáng)后者的抗腫瘤血管生成的作用。但必須強(qiáng)調(diào)的是：本實(shí)驗(yàn)也僅僅發(fā)是現(xiàn)了這一現(xiàn)象，并不能由此即做出貝伐珠單抗能增強(qiáng)重組人血管內(nèi)皮抑制素抑制淋巴管形成作用的推斷。由于腫瘤的脈管調(diào)節(jié)機(jī)制是一個(gè)巨大而復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，目前人類還很難全面了解，所以具體的作用機(jī)制還需要更多的研究才能明確。

4 結(jié)論

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)了兩種抗血管治療藥物在動(dòng)物體內(nèi)抗腫瘤作用的差異，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)兩者聯(lián)合使用有相加作用。腫瘤的血管和淋巴管生成是一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，本實(shí)驗(yàn)的重要性在于第一次在同一個(gè)試驗(yàn)?zāi)Ｐ拖聦?duì)兩種常用的抗腫瘤血管生成的藥物療效進(jìn)行了分析，第一次發(fā)現(xiàn)了兩種藥物聯(lián)合使用后效果較單獨(dú)用藥更顯著，存在相加作用。而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也并未發(fā)現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物因?yàn)槁?lián)合用藥出現(xiàn)嚴(yán)重致死的毒副反應(yīng)。這為以后進(jìn)一步通過(guò)這些現(xiàn)象了解腫瘤脈管形成的復(fù)雜調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)提供了一個(gè)新的切入點(diǎn)，也為臨床進(jìn)一步改善抗血管治療的效果提供了新的思路。