木醋桿菌分批補料發(fā)酵法生產(chǎn)廣式米醋

傅 亮 易九龍 陳思謙 吳炳鴻

（1.暨南大學食品科學與工程系，廣東 廣州 510632；2.廣州市如豐果子調味食品有限公司，廣東 廣州 511330）

傳統(tǒng)的廣式米醋通常以米酒及食用酒精為原料，以木醋桿菌（Gluconacetobacter xylinus）作為主要產(chǎn)酸菌，采用表面靜止發(fā)酵法生產(chǎn)［1］。發(fā)酵周期一般為40d以上，發(fā)酵總酸在3.5～4.5g／100mL，業(yè)內普遍認為廣式米醋的發(fā)展應縮短發(fā)酵時間，提高發(fā)酵酸度。生產(chǎn)實踐中發(fā)現(xiàn)，采用分批補料發(fā)酵法生產(chǎn)的廣式米醋總酸，高于單批發(fā)酵總酸度。武斌等［2］研究也表明，以巴氏醋桿菌為菌種采用分批發(fā)酵法能明顯提高醋酸度和乙醇轉化率，縮短生產(chǎn)周期，節(jié)約成本。

本試驗采用廣州如豐果子調味食品有限公司在發(fā)酵車間分離的木醋桿菌菌株RF4作為發(fā)酵菌種，研究發(fā)酵總酸的變化規(guī)律，比較發(fā)酵過程中纖維素膜內與發(fā)酵液中菌體數(shù)的差異，探討最適原料酒精度，并研究通過在發(fā)酵過程中采用分批補料法提高總酸的可行性并進行工藝參數(shù)的優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

菌種：自廣州如豐果子調味食品有限公司米醋生產(chǎn)車間分離出的主要產(chǎn)酸菌RF4，經(jīng)16SrDNA鑒定為葡糖醋桿菌屬的木醋桿菌 （Gluconacetobacter xylinus）［3］；

纖維素酶：酶活18 391U／g，美國Sigma公司；

乙醇、碳酸鈣、氫氧化鈉等：分析純，天津市大茂化學試劑廠。

1.1.2 主要儀器設備

電子天平：HR－120型，上海精密科學儀器有限公司；

高壓蒸汽滅菌器：YQX－SG46－280S型，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；

超凈工作臺：SW－CJ－1BU型，蘇州安泰空氣技術有限公司；

生化培養(yǎng)箱：PYX－190－A型，上海躍進醫(yī)療器械有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種及培養(yǎng)基的制備

（1）液體菌種的制備［4］：10mg／mL葡萄糖、10mg／mL酵母粉，121℃滅菌20min，冷卻至70℃左右加入5%乙醇（V／V），冷卻至室溫后接種RF4斜面菌種30℃下培養(yǎng)7d，菌落數(shù)測定為1.83×107CFU／mL。

（2）發(fā)酵液的制備［5］：10mg／mL葡萄糖、10mg／mL酵母粉，121℃滅菌20min，冷卻至70℃左右加入5%乙醇（V／V），冷卻至室溫后接種5% （V／V）菌種培養(yǎng)液，裝液量為150mL，30℃下于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

（3）平 板 計 數(shù) 培 養(yǎng) 基 的 制 備［6］：10mg／mL 葡 萄 糖、10mg／mL酵 母 粉、20mg／mL 碳 酸 鈣、15mg／mL 瓊 脂，121℃滅菌20min，冷卻至70℃左右加入3%無水乙醇，制成碳酸鈣平板備用。

1.2.2 發(fā)酵總酸的測定 參照GB／T 5009.41——2003。

1.2.3 發(fā)酵液及細菌纖維素膜內木醋桿菌菌體數(shù)的測定

（1）細菌纖維素膜酶解液制備［7］：準確稱量發(fā)酵液中生成的完整濕狀細菌纖維素膜0.5g，加入0.1% （V／V）已活化好的纖維素酶溶液，用醋酸－醋酸鈉緩沖溶液調pH至5.0，蒸餾水定容至10mL，35℃水浴至膜完全崩解，得纖維素膜酶解液。

（2）平板菌落計數(shù)法［8］：以梯度稀釋法分別接種木醋桿菌發(fā)酵液和細菌纖維素膜酶解液，30℃恒溫培養(yǎng)96h。選取菌落周圍出現(xiàn)透明圈的菌落計數(shù)，根據(jù)梯度稀釋倍數(shù)計算實際菌體數(shù)。從發(fā)酵第4天開始，每3d測定1次菌落數(shù)至第16天，單位CFU／g。

1.2.4 發(fā)酵過程中補加乙醇可行性試驗與總酸測定 在發(fā)酵至第10天時補加2%（乙醇體積／發(fā)酵液體積）乙醇1次，每2d測定1次總酸，測定至第20天。

1.2.5 分批補料發(fā)酵最優(yōu)條件的確定 對分批補料發(fā)酵液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，取每次乙醇添加量、間隔時間、開始補加時間及補加次數(shù)為因素進行四因素三水平的正交試驗，因素水平表見表1。以發(fā)酵液中總酸為指標進行因素水平的評價。以上每組試驗均做3次平行，要求誤差小于5%，取算術平均值。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵液和細菌纖維素膜內木醋桿菌菌落數(shù)分布比較

木醋桿菌發(fā)酵產(chǎn)酸過程中，細菌纖維素膜及發(fā)酵液內都存在菌體。由比較結果（表2）可知，纖維素膜內及發(fā)酵液中的木醋桿菌菌體數(shù)自發(fā)酵第4天開始顯著上升，第10天左右分別達到峰值，然后基本維持穩(wěn)定，為菌體生長穩(wěn)定期。隨著底物的耗盡和產(chǎn)物的積累，二者的菌體數(shù)在第13天時均開始下降，至第16天分別為0.98×1010CFU／g和4.00×107CFU／g，在整個發(fā)酵過程中，細菌纖維素膜內的細胞數(shù)均遠高于發(fā)酵液內的細胞數(shù)，前者在第10天時約為后者的300倍。結果表明，傳統(tǒng)的廣式米醋生產(chǎn)采用表面發(fā)酵法有利于菌體大量集中在氣液交界的膜中，有助于耗氧代謝及傳質，有利于發(fā)酵產(chǎn)酸，隨后的分批補料發(fā)酵也應維持細菌纖維素膜的完整性。

表1 因子水平表Table 1 Factor level table

表2 發(fā)酵液及細菌纖維素膜內木醋桿菌菌體數(shù)Table 2 Cell number of Gluconacetobacter xylinus in fermented liquid and bacterial cellulose membrane

2.2 初始酒精度對木醋桿菌發(fā)酵產(chǎn)酸的影響

木醋桿菌在發(fā)酵過程中，酒精濃度的高低會影響菌體的生長和代謝［8，9］。初始酒精度對產(chǎn)酸影響見圖1。在酒精含量為5% （V／V）時總酸可達4.2g／100mL左右，為其最適原料酒精度。

2.3 分批補料發(fā)酵提高總酸度的初步可行性

由圖2可知，不補加乙醇組在第12天左右酸度達到最大值，初步確定在第10天補加乙醇，補加乙醇組在第16天酸度達到最大值（5.35g／100mL），且遠高于不補加乙醇組。由此可見，發(fā)酵過程中補加乙醇可以提高最終總酸，通過分批補料法發(fā)酵提高廣式米醋總酸是可行的。

圖1 不同酒精含量對產(chǎn)酸的影響Figure 1 Total acidity under different alcohol content

圖2 單批發(fā)酵法與補料法所產(chǎn)總酸度比較Figure 2 Total acidity of single batch fermentation and fed－batch fermentation

2.4 補料發(fā)酵最優(yōu)條件的確定及驗證實驗

正交優(yōu)化試驗結果見表3。由表3可知，補料發(fā)酵過程中影響發(fā)酵產(chǎn)酸量的因素主次順序為A＞B＞C＞D，即乙醇添加量＞間隔時間＞開始補加時間＞補加次數(shù)，最優(yōu)組合為A3B1C1D2，即每次乙醇添加3mL，占發(fā)酵液體積2%，間隔時間為2d，在發(fā)酵第6天開始補加，補加次數(shù)為3次。按照最優(yōu)組合A3B1C1D2進行驗證實驗，重復5次并以單批發(fā)酵作對比，最優(yōu)組合產(chǎn)酸量均穩(wěn)定在7.29g／100mL，而單批發(fā)酵僅為4.20g／100mL。

3 結論

（1）分批補料發(fā)酵法提高廣式米醋總酸的最佳工藝為在發(fā)酵第6天開始，每隔2d添加發(fā)酵液體積2%的酒精，補加3次，最終酸度可達7.29g／100mL，較單批發(fā)酵提高了73.6%。

表3 補料發(fā)酵正交試驗結果與分析Table 3 Orthogonal experiment design and analysis of fed－batch fermentation

（2）由于木醋桿菌在發(fā)酵過程中的最適酒精度為5%（V／V），較低的酒精量導致醋酸產(chǎn)量低，過高的酒精含量則會抑制木醋桿菌的生長代謝，單批發(fā)酵受制于此難以生產(chǎn)出高酸度米醋。本試驗通過補加酒精法發(fā)酵既滿足了木醋桿菌產(chǎn)酸的需要，又不致于酒精度過高而抑制其生長代謝，研究結果對于生產(chǎn)廣式高酸米醋具有積極意義。

（3）本試驗僅以酸度為指標對分批補料發(fā)酵法的工藝進行了優(yōu)化，對于如何在提高酸度的同時改善米醋其它風味品質還有待于更深入的研究。

（4）特別值得注意的是，傳統(tǒng)的廣式米醋發(fā)酵所用的木醋桿菌，在發(fā)酵產(chǎn)酸的同時會合成細菌纖維素膜漂浮于發(fā)酵液表面，與中國其它醋種發(fā)酵有顯著不同的特征。以酒精為代表的碳源，在轉化為醋酸的同時，也合成了細菌纖維素。本試驗研究表明細菌纖維素膜的存在，有助于富集大量菌體于膜內，且漂浮于發(fā)酵液表面有助于利用空氣中的氧，并進一步有助于氧化酒精轉化成乙酸。故分批補料過程中，不得破壞細菌纖維素膜。生產(chǎn)實踐中也發(fā)現(xiàn)，纖維素膜完整性的破壞，會極大降低最終制品的總酸。因此，如何在發(fā)酵過程中保持纖維素膜的完整性，如何將乙醇盡量多的轉化為乙酸，都為下一步設計高效連續(xù)生產(chǎn)的生化反應器、調整生產(chǎn)工藝提出了新的課題。

1 傅亮，陳思謙，易九龍，等.細菌纖維素膜對木醋桿菌發(fā)酵生產(chǎn)廣式米醋的影響［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38（2）：123～125.

2 武斌，李麗，趙良啟.醋酸菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化及醋酸分批發(fā)酵［J］.食品與藥品，2007，9（1）：11～14.

3 傅亮，易九龍，陳思謙，等.傳統(tǒng)廣式米醋中醋酸菌的分離與鑒定［J］.中國調味品，2012，37（6）：57～60.

4 臧晉，劉鳳霞，李永祥，等.高產(chǎn)醋酸菌的分離選育［J］.中國釀造，1999（5）：20～22.

5 陳義倫.優(yōu)質蘋果醋釀造技術及主要風味物質研究［D］.濟南：山東農(nóng)業(yè)大學，2002.

6 魏長慶，王海慶，張凌，等.葡萄果醋發(fā)酵用醋酸菌的分離及鑒定［J］.中國釀造，2010（4）：42～45.

7 賈士儒，歐竑宇，馬霞，等.細菌纖維素結構與性質的初步研究［J］.纖維素科學與技術，2002，10（3）：25～29.

8 侯小歌，杜紅陽，李學思，等.宋河大曲中醋酸菌的分離鑒定及產(chǎn)酸特性［J］.中國釀造，2011（4）：112～115.

9 Kiyoshi T，Tomoko A，Masahiro F，et al.Cellulose production by acetic acid－resistant Acetobacter xulinum ［J］.Journal of Fermentation and Bioengineering，1997，84（3）：228～231.