牦牛血粉制備氯化血紅素工藝優(yōu)化研究

高子涵，張衛(wèi)兵，* ，梁 琪，楊 敏，張 炎，高維東，李曉鵬，劉興龍

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070;2.甘肅省功能乳品工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730070;3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，甘肅蘭州730070)

牦牛是青藏高原特有的優(yōu)勢(shì)畜種，具有極強(qiáng)的抗逆性、抗病性、耐受性和適應(yīng)性。全世界現(xiàn)有牦牛約1500萬(wàn)頭，中國(guó)是牦牛的主產(chǎn)國(guó)，占世界總數(shù)的92%左右，主要分布于西藏、四川、青海、甘肅、新疆等省區(qū)［1－2］。目前，對(duì)于牦牛肉、乳的利用較為充分，而牦牛血液由于腥味較重、適口性差，因而利用率不高。牦牛血液中血紅蛋白(Hb)含量很高，達(dá)到(86.41±13.07)g/L，全血鐵的含量為(28.95±4.37)mmol/L，高于豬血液中的含量［3］，因而牦牛血是制取血紅素類產(chǎn)品的天然優(yōu)質(zhì)資源，加以利用后能夠產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益［4－5］。血紅素(heme)是血紅蛋白分子的輔基，在干燥的固體狀態(tài)下較穩(wěn)定，但在光照或有氧化劑存在下極不穩(wěn)定，會(huì)很快被氧化［6－7］。當(dāng)血紅素與珠蛋白脫離后亞鐵自動(dòng)氧化成三價(jià)鐵，所以從動(dòng)物血液中得到的血紅素產(chǎn)品一般是氯化高鐵血紅素(簡(jiǎn)稱氯化血紅素，Hemin)。氯化血紅素是吸收率最高的生物態(tài)鐵劑，具有無(wú)體內(nèi)鐵蓄積中毒、不受膳食因素的影響、不會(huì)產(chǎn)生消化道刺激癥狀等特點(diǎn)，已經(jīng)成為比較理想的抗貧血藥［8－9］，并且其藥理已被臨床證實(shí)。美國(guó)FDA 于1983年7月正式批準(zhǔn)氯化血紅素作為藥品使用。同時(shí)，氯化血紅素在醫(yī)藥行業(yè)中已被廣泛應(yīng)用于血卟啉及其衍生物的制備［10］。目前已有的報(bào)道大多都是以動(dòng)物血液為原料制備氯化血紅素，其方法主要有酸性丙酮法、羧甲基纖維素法和冰醋酸法等。但由于新鮮血液不易運(yùn)輸和貯藏，以其為原料制備氯化血紅素會(huì)使生產(chǎn)成本提高。本實(shí)驗(yàn)旨在研究以牦牛血粉為原料制備氯化血紅素的工藝條件，為牦牛血粉的綜合利用和氯化血紅素的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牦牛血粉 蘭州天和生物催化技術(shù)有限公司;氯化血紅素標(biāo)準(zhǔn)品 Sigma公司;其他試劑 市售，國(guó)產(chǎn)分析純或化學(xué)純。

LabTech紫外可見分光光度計(jì) 北京萊伯泰科儀器有限公司;TDD5M低速離心機(jī) 長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司;PHS－3C型數(shù)顯酸度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;AL204電子天平 梅特勒－托利多儀器有限公司;電熱鼓風(fēng)干燥器 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;超聲波清洗器 江蘇昆山超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 以牦牛血粉為原料制備氯化血紅素的工藝 準(zhǔn)確稱取2g牦牛血粉，加入30mL 6mol/L的脲溶液中，超聲處理30min后3000r/min離心10min;向上清液中加入3%酸性丙酮150mL，攪拌抽提30min，再加入3%乙酸鈉11mL攪拌均勻，然后用1mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH為7.0，3000r/min離心10min，沉淀用蒸餾水和無(wú)水乙醇洗滌后烘干，得到氯化血紅素。

1.2.2 氯化血紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線制作及樣品中氯化血紅素的測(cè)定

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 氯化血紅素標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)105℃干燥至恒重，配制成不同濃度的氯化血紅素溶液，在最大吸收波長(zhǎng)390nm處測(cè)定氯化血紅素標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，以氯化血紅素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.2 樣品中氯化血紅素的測(cè)定［11］取經(jīng)過(guò)105℃干燥至恒重的氯化血紅素樣品，研成粉末;精密稱取適量樣品，置于100mL燒杯中，加0.1mol/L的氫氧化鈉溶液溶解，將溶液轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中，加0.1mol/L的氫氧化鈉溶液至刻度，搖勻，過(guò)濾。取濾液10mL于100mL容量瓶中，用0.1mol/L氫氧化鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，以0.1mol/L的氫氧化鈉溶液為空白，在390nm處測(cè)定樣品的吸光度。根據(jù)血紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到樣品中氯化血紅素的質(zhì)量，計(jì)算樣品中血紅素的純度。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 分別選取超聲處理時(shí)間(10、20、30、40、50min)、酸性丙酮加入量(90、120、150、180、210mL)、抽提時(shí)間(10、20、30、40、50min)和乙酸鈉的加入量(2、5、8、11、14mL)4 個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，測(cè)定所得氯化血紅素的質(zhì)量并計(jì)算含量。

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，超聲處理時(shí)間、酸性丙酮加入量、抽提時(shí)間和乙酸鈉的加入量4個(gè)因素各取3個(gè)水平，采用L9(34)正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，以進(jìn)一步優(yōu)化以牦牛血粉為原料制備氯化血紅素的工藝參數(shù)。正交實(shí)驗(yàn)因素水平表見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲處理時(shí)間對(duì)氯化血紅素得率的影響 在氯化血紅素的制備過(guò)程中，分別調(diào)整超聲處理時(shí)間為 10、20、30、40、50min，其他條件與 1.2.1 相同，以考察不同超聲處理時(shí)間對(duì)氯化血紅素含量的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 超聲處理時(shí)間對(duì)氯化血紅素含量的影響Fig.1 The effect of ultrasonic breaking time on the yield of hemin

由圖1可以看出，隨著超聲處理時(shí)間的延長(zhǎng)，氯化血紅素的含量先上升后下降。當(dāng)超聲處理時(shí)間從10min增加到30min時(shí)，氯化血紅素的含量逐漸增加，當(dāng)超聲處理時(shí)間為30min時(shí)，含量達(dá)到最高，為2.08mg/g。當(dāng)處理時(shí)間超過(guò)30min以后，氯化血紅素含量逐漸降低，這是因?yàn)槌曁幚頃r(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，釋放出大量的聲波，溫度升高幅度過(guò)大，使血粉中的蛋白質(zhì)變性，其中結(jié)合的氯化血紅素難以釋放，從而影響氯化血紅素的產(chǎn)量［11］。

2.1.2 酸性丙酮加入量對(duì)氯化血紅素得率的影響在氯化血紅素的制備過(guò)程中，分別調(diào)整酸性丙酮加入的量分別為 90、120、150、180、210mL，其他條件與1.2.1相同，以考察不同酸性丙酮加入量對(duì)氯化血紅素含量的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 酸性丙酮加入量對(duì)氯化血紅素含量的影響Fig.2 The effect of the amount of acetone acidified on the yield of hemin

氯化血紅素易溶于酸性丙酮液，這是采用酸性丙酮法制備氯化血紅素的基本原理，酸性丙酮液的加入量對(duì)于氯化血紅素從蛋白中的解離影響較大［12］。由圖2可以看出，當(dāng)酸性丙酮加入量由90mL增加到150mL時(shí)，氯化血紅素的含量逐漸增加，當(dāng)酸性丙酮加入量為150mL時(shí)，氯化血紅素含量達(dá)到最高(2.11mg/g)。當(dāng)酸性丙酮加入量超過(guò)150mL以后，氯化血紅素含量增速減緩，加入量為210mL時(shí)，含量反而降為2.10mg/g。由于生產(chǎn)中要節(jié)約成本，應(yīng)該選擇的酸性丙酮加入量為150mL。

表3 正交實(shí)驗(yàn)方差分析表Table 3 The variance analysis of orthogonal test

2.1.3 抽提時(shí)間對(duì)氯化血紅素得率的影響 在氯化血紅素的制備過(guò)程中，分別調(diào)整加入酸性丙酮后抽提時(shí)間為 10、20、30、40、50min，其他條件與 1.2.1 相同，以考察不同抽提時(shí)間對(duì)氯化血紅素含量的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 抽提時(shí)間對(duì)氯化血紅素含量的影響Fig.3 The effect of the extraction time on the yield of hemin

由圖3可以看出，隨著抽提時(shí)間的延長(zhǎng)，氯化血紅素的含量逐漸增加。當(dāng)抽提時(shí)間由10min增加到30min時(shí)，氯化血紅素的含量逐漸增加。當(dāng)抽提時(shí)間為30min時(shí)，氯化血紅素的含量最高(2.14mg/g)。而當(dāng)抽提時(shí)間超過(guò)30min時(shí)，抽提時(shí)間對(duì)氯化血紅素含量的影響逐漸變小，含量增加緩慢，抽提時(shí)間為50min時(shí)，含量?jī)H增加0.01mg/g。由于生產(chǎn)中要盡量縮短生產(chǎn)周期，所以選用的抽提時(shí)間為30min。

2.1.4 乙酸鈉加入量對(duì)氯化血紅素得率的影響 乙酸鈉是氯化血紅素提取時(shí)的沉淀劑，可以使溶液中氯化血紅素沉淀下來(lái)。在氯化血紅素的制備過(guò)程中，分別調(diào)整乙酸鈉的加入量為 2、5、8、11、14mL，其他條件與1.2.1相同，以考察不同乙酸鈉加入量對(duì)氯化血紅素含量的影響，結(jié)果見圖4。

由圖4可以看出，隨著乙酸鈉加入量的增加，氯化血紅素的含量先增加后降低。當(dāng)乙酸鈉加入量由2mL增加到8mL時(shí)，氯化血紅素的含量增加顯著(p＜0.05)。當(dāng)乙酸鈉加入量為8mL時(shí)，氯化血紅素的含量達(dá)到2.18mg/g。而當(dāng)乙酸鈉加入量大于8mL時(shí)，氯化血紅素含量有所下降。因?yàn)殡S著乙酸鈉加入量的增加，開始會(huì)有更多的氯化血紅素沉淀出來(lái)，但當(dāng)乙酸鈉的加入過(guò)量時(shí)，不溶解的乙酸鈉會(huì)混入氯化血紅素，降低產(chǎn)品的純度［13］。由于生產(chǎn)中要盡量節(jié)約成本，所以選用的選用乙酸鈉加入量為8mL。

圖4 乙酸鈉加入量對(duì)氯化血紅素含量的影響Fig.4 The effect of the amount of sodium acetate on the yield of hemin

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果直觀分析 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以氯化血紅素含量為指標(biāo)，4個(gè)因素各取3個(gè)水平，采用L9(34)正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果和方差分析分別見表2和表3。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of orthogonal test

由表2可以看出，四個(gè)因素對(duì)產(chǎn)量的影響作用由大到小依次為:乙酸鈉加入量＞抽提時(shí)間＞酸性丙酮加入量＞超聲處理時(shí)間。同時(shí)得到制備氯化血紅素的最優(yōu)參數(shù)組合為A2B2C2D3，即超聲處理時(shí)間30min，酸性丙酮加入150mL，抽提時(shí)間30min，乙酸鈉加入量為11mL。同時(shí)，由表3的方差分析結(jié)果可以看出，乙酸鈉加入量對(duì)氯化血紅素含量的影響極顯著(p＜0.0001)，抽提時(shí)間對(duì)氯化血紅素含量的影響較顯著(p=0.053)，而酸性丙酮加入量和超聲處理時(shí)間對(duì)氯化血紅素含量的影響不顯著(p＞0.05)。

2.2.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果 由于最優(yōu)組合不包含在正交實(shí)驗(yàn)表中，為了進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在最優(yōu)組合A2B2C2D3對(duì)應(yīng)的條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次。結(jié)果表明，在此條件下，氯化血紅素的含量達(dá)到2.30mg/g，比正交實(shí)驗(yàn)中任何一種組合的含量都高，說(shuō)明正交實(shí)驗(yàn)確定的工藝參數(shù)是可靠的。因此，實(shí)驗(yàn)最終確定的最佳工藝參數(shù)為超聲處理時(shí)間30min、酸性丙酮加入量150mL、抽提時(shí)間30min、乙酸鈉加入量11mL。

3 結(jié)論

采用單因素實(shí)驗(yàn)，對(duì)牦牛血粉制備氯化血紅素的4個(gè)因素(超聲波處理時(shí)間、酸性丙酮的添加量、提取的時(shí)間、乙酸鈉的添加量)進(jìn)行初步研究。在此基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化，得到的最優(yōu)制備工藝參數(shù)為:超聲處理時(shí)間30min，酸性丙酮加入 150mL，抽提時(shí)間 30min，乙酸鈉加入量為11mL。在此條件下，氯化血紅素的含量為2.30mg/g。

［1］何如喜.牦牛血液資源利用技術(shù)的可行性研究［J］.中國(guó)資源綜合利用，2006，24(12):11－13.

［2］牛春娥，張利平.我國(guó)牦牛資源現(xiàn)狀及其產(chǎn)品開發(fā)利用前景分析［J］.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009，37(17):8003－8005.

［3］盧福山，張才俊.高原型牦牛8項(xiàng)血液指標(biāo)的測(cè)定［J］.青海畜牧獸醫(yī)雜志，2006，36(4):3－4.

［4］吳海玥，靳義超，胡勇.牦牛血液中高純度血紅素的提取實(shí)驗(yàn)研究［J］.青海畜牧獸醫(yī)雜志，2011，41(5):25－27.

［5］劉振斌，張珍，張盛貴，等.CMC－Na法提取牦牛血紅素的工藝研究［J］.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，47(4):143－146.

［6］Lebrun F，Bazus A.Solubility of heme in heme－iron enriched bovine hemoglobin hydrolysate［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1998，46:5017－5025.

［7］劉寶巖，張翼，李法慶.一種從牦牛血中提取血紅素的方法［P］.中國(guó):CN201110119384.5，2011－5－10.

［8］劉婭，韓新年.天然補(bǔ)鐵劑－血紅素鐵的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)食品添加劑，2005(4):5－8.

［9］尹兆明，段黎萍，楊勇.從動(dòng)物血液中提取血紅素的方法［P］.中國(guó):CN01102839.4，2001－2－7.

［10］王君，陳紅亮，張向東，等.氯化血紅素提取新工藝［J］.當(dāng)代化工，2001，30(3):126－127.

［11］馬永征，宋宏新，李敏康.氯化血紅素提取中超聲波細(xì)胞破碎條件的研究［D］.西安:陜西科技大學(xué)，2005.

［12］劉任民，范萬(wàn)東，王搖風(fēng)，等.豬血中高純度血紅素的提取工藝［J］.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2007，23(18):2687－2689.

［13］葛靜微，羅均，李小定，等.響應(yīng)面分析法優(yōu)化血紅素提取工藝［J］.食品科學(xué)，2010，31(8):60－64.