基于腦梗死大鼠模型的針刺指標(biāo)對針刺效應(yīng)影響的均值加權(quán)分類評價*

常曉波 樊小農(nóng) 王舒 孟智宏 楊雪 石學(xué)敏,6

（1天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 天津 300193；2國家中醫(yī)藥管理局針刺量效關(guān)系三級實驗室 天津 300193；3國家中醫(yī)藥管理局腦病針刺療法重點研究室 天津 300193；4江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 南昌 330006；5天津工業(yè)大學(xué)數(shù)理學(xué)院 天津 300387；6天津市針灸學(xué)重點實驗室 天津 300193）

基于腦梗死大鼠模型的針刺指標(biāo)對針刺效應(yīng)影響的均值加權(quán)分類評價*

常曉波1,4樊小農(nóng)1,2王舒1,3#孟智宏1楊雪5石學(xué)敏1,6

（1天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 天津 300193；2國家中醫(yī)藥管理局針刺量效關(guān)系三級實驗室 天津 300193；3國家中醫(yī)藥管理局腦病針刺療法重點研究室 天津 300193；4江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 南昌 330006；5天津工業(yè)大學(xué)數(shù)理學(xué)院 天津 300387；6天津市針灸學(xué)重點實驗室 天津 300193）

目的：評價針刺指標(biāo)對大腦中動脈梗死（MCAo）大鼠模型的針刺效應(yīng)的影響，以此來初步探討針刺治療腦梗死的作用機制，并為腦梗死針刺治療方案提供理論依據(jù)。方法：本實驗以Zea-1onga線拴法復(fù)制MCAo大鼠模型。造模成功后依據(jù)Zausinger六分法選擇1～3分的大鼠隨機入組。以隨機對照設(shè)計原則設(shè)立基礎(chǔ)對照組（正常組、模型對照組、模型未干預(yù)組）和針刺組（內(nèi)關(guān)組、委中組、三陰交組、尺澤組、人中組和非穴組）。而且針刺組內(nèi)每個穴組采用正交設(shè)計法分別設(shè)置9個不同參數(shù)組合。根據(jù)各組別所對應(yīng)的針刺參數(shù)分別進行提插手法針刺治療，每12小時1次，共干預(yù)6次。每組12只，共57組。并以神經(jīng)行為學(xué)、腦血流、梗死率、微循環(huán)、光鏡等為測量指標(biāo)，評價針刺指標(biāo)對MCAo大鼠模型的針刺效應(yīng)的影響。結(jié)果：內(nèi)關(guān)穴在降低梗死率、擴張輸入枝管徑、提高神經(jīng)行為學(xué)評分表現(xiàn)的最突出；委中穴在增加腦血流、提高神經(jīng)行為學(xué)方面表現(xiàn)最佳；尺澤穴在增加腦血流、擴張輸出枝管徑、提高正常神經(jīng)細(xì)胞數(shù)方面表現(xiàn)最好；三陰交在減少壞死神經(jīng)細(xì)胞和噬神經(jīng)細(xì)胞、降低壞死神經(jīng)細(xì)胞率、提高神經(jīng)行為學(xué)評分方面表現(xiàn)最優(yōu)。結(jié)論：針刺治療腦梗死療效確切，其機制可能是通過改善微循環(huán)、增加腦血流量、降低梗死率、降低壞死神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)、減少噬神經(jīng)細(xì)胞數(shù)從而提高神經(jīng)行為學(xué)評分來實現(xiàn)的，為腦梗死的針刺治療方案提供理論依據(jù)。

大腦中動脈梗死大鼠模型；針刺指標(biāo)；針刺效應(yīng)；均值加權(quán)分類法評估

*國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（973計劃）資助項目：2012CB518505、2006CB504504、2010CB530500國家自然科學(xué)基金委員會資助項目：81360607

#通訊作者：王舒，E-mai1：wangs2008@163.com

腦血管病是神經(jīng)系統(tǒng)常見病及多發(fā)病，目前已成為危害我國中老年人群人身健康和生命的主要原因，其發(fā)病率、致殘率、死亡率均高，是導(dǎo)致人類死亡的三大疾病之一，給社會和家庭造成嚴(yán)重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。本病是最廣泛應(yīng)用針灸治療的適應(yīng)證之一，其療效已為針灸界公認(rèn)。但效應(yīng)評價指標(biāo)不一，取穴及手法各異，電針參數(shù)不統(tǒng)一，使各個研究的療效不具可比性，沒有形成規(guī)范化的治療方案，而且大樣本隨機對照實驗較少見。為此，本研究以大樣本隨機對照法為實驗原則，以評價針刺指標(biāo)對大腦中動脈梗死（MCAo）大鼠模型的針刺效應(yīng)的影響，從而探討針刺治療腦梗死的作用機制，為腦梗死針刺治療方案提供理論依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1 動物來源及分組 選用體重250～300 g的三級動物（specific pathogen free anima1s，SPF）的成年健康雄性Wister大鼠，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供。隨機分組：對照組（包括正常組、模型對照組、模型未干預(yù)組）和針刺組（包括人中組、尺澤組、內(nèi)關(guān)組、三陰交組、委中組、非穴組）。其中，每個經(jīng)穴組又分為9個針刺參數(shù)組。每組12只，共57組。

1.2 MCAo動物模型的復(fù)制及造模成功判定 參照Zea-Longa線拴法[1]復(fù)制大腦中動脈缺血模型（midd1e cerebra1 artery occ1usion，MCAo）。大鼠造模清醒后，按Zausinger六分法[2]對其神經(jīng)功能進行評分，去除評分為4分和5分的動物。

1.3 針刺干預(yù)方法 依據(jù)《實驗針灸學(xué)》[3]的常用實驗動物針灸穴位定位，選用內(nèi)關(guān)、委中、尺澤、三陰交、人中和非穴等共6個穴位進行提插手法針刺，非穴點取脅下固定點（穴取患側(cè)肋下髂嵴上10 mm的固定點處）作為對照。非穴組：造模成功后待大鼠清醒，選取大鼠患側(cè)（即右側(cè)肢體）脅下處一個非經(jīng)非穴點針刺，每12小時1次，共干預(yù)6次。正常組：不實施造模手術(shù)及針刺干預(yù)，但也同等條件抓取，同樣抓取6次。模型對照組：造模成功后，待大鼠完全清醒，不實施任何針刺，立即給予腦血流量、微循環(huán)的測定，之后斷頭取材（腦組織）測量光鏡、梗死率等指標(biāo)。模型未干組（未針刺組）：造模成功后在相應(yīng)時間段內(nèi)，用與針刺組實施同等條件的抓取，但不實施任何針刺干預(yù)，共抓取6次。針具用蘇州醫(yī)療用品廠生產(chǎn)的“華佗牌”毫針，長1.5寸，直徑0.32 mm。除對照組外，其余各組干預(yù)方法，依據(jù)針刺參數(shù)的2因素（針刺頻率與針刺時間）與3水平（頻率的快中慢，即180次/min、120次/min、60次 /min；與時間的短中長，即 5 s、60 s、180 s）的正交設(shè)計法，進行神經(jīng)行為學(xué)的研究（針刺參數(shù)組合參見表1）。造模成功后待大鼠清醒1 h左右，即給予第1次針刺干預(yù)。以后每12小時干預(yù)1次，72 h共針刺6次。

表1 九種不同針刺參數(shù)組合

1.4 效應(yīng)指標(biāo) MCAo大鼠神經(jīng)功能評分、軟腦膜腦血流及微循環(huán)的測定、腦缺血面積（梗死率）的測定、光鏡觀察的具體方法請參閱本課題的相關(guān)研究[4]，在此不再贅述。

1.5 統(tǒng)計方法 采用SPSS17.0計算下的各個經(jīng)穴的每個測量指標(biāo)的平均值，以均值加減標(biāo)準(zhǔn)差表示。然后按照平均值加權(quán)分類法經(jīng)穴組的總得分并比較大小。

2 結(jié)果

2.1 對照組均值比較 經(jīng)過均值比較，以正常組、模型對照組、模型未干組等三個組作為分界點或標(biāo)準(zhǔn)是有統(tǒng)計學(xué)意義的（除外A/V比值和微血管數(shù)各組別的的均值變化不大，所以在此無法做比較）。雖然有些指標(biāo)如微循環(huán)輸入枝中的正常組與模型未干組比較P=0.086，大于0.05小于0.1，還是可以接受的，所以用這幾個對照組作為標(biāo)準(zhǔn)還是可行的。

2.2 各個指標(biāo)分類比較 見表2～表10。結(jié)果顯示，內(nèi)關(guān)穴在降低梗死率、擴張輸入枝管徑、提高神經(jīng)行為學(xué)評分表現(xiàn)的最突出；委中穴在增加腦血流、提高神經(jīng)行為學(xué)方面表現(xiàn)最佳；尺澤穴在增加腦血流、擴張輸出枝管徑、提高正常神經(jīng)細(xì)胞數(shù)方面表現(xiàn)最好；三陰交在減少壞死神經(jīng)細(xì)胞和噬神經(jīng)細(xì)胞、降低壞死神經(jīng)細(xì)胞率、提高神經(jīng)行為學(xué)評分方面表現(xiàn)最優(yōu)。說明針刺治療腦梗死療效確切，其機制可能是通過改善微循環(huán)、增加腦血流量、降低梗死率、降低壞死神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)、減少噬神經(jīng)細(xì)胞數(shù)從而提高神經(jīng)行為學(xué)評分來實現(xiàn)的，為腦梗死的針刺治療方案提供了理論依據(jù)。

表2 梗死比率指標(biāo)分類比較

由表2可知：在降低梗死率指標(biāo)上，內(nèi)關(guān)穴最好，其次是委中，再次是尺澤和人中，然后是三陰交，最次的是非穴。

表3 腦血流量分類比較

由表3可知：在增加腦血流指標(biāo)上，委中、尺澤表現(xiàn)最好，其次是三陰交，再次是內(nèi)關(guān)，然后是人中，最后是非穴。

表4 輸入枝（A）分類比較

由表4可知：在微循環(huán)輸入枝指標(biāo)中，內(nèi)關(guān)表現(xiàn)最好，其次是委中、尺澤、三陰交，再次就是人中和非穴。

表5 輸出枝（V）分類比較

由表5可知：在微循環(huán)輸出枝指標(biāo)中，最好的是尺澤，其次是委中和三陰交，再次就是內(nèi)關(guān)、人中和非穴。

表6 正常神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)分類比較

由表6可知：在光鏡-正常神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)指標(biāo)中，尺澤最好，其次分別是委中、內(nèi)關(guān)、人中、非穴，最后的是三陰交。

表7 壞死神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)分類比較

由表7可知：在光鏡-壞死神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)指標(biāo)中，最好的是三陰交，其次是尺澤、人中，再次是非穴，最后的是內(nèi)關(guān)和委中。

表8 噬神經(jīng)細(xì)胞數(shù)分類比較

由表8可知：在光鏡-噬神經(jīng)細(xì)胞數(shù)指標(biāo)中，最好的是三陰交，其次是尺澤，再次是人中，然后是內(nèi)關(guān)、非穴，最后的是委中。

表9 壞死神經(jīng)元細(xì)胞率分類比較

由表9可知：在光鏡-壞死神經(jīng)元細(xì)胞率指標(biāo)中，最好的是三陰交，其次是尺澤和人中，再次就是內(nèi)關(guān)、委中、非穴。

表10 神經(jīng)行為學(xué)評分

由表10可知：在神經(jīng)行為學(xué)評分指標(biāo)中，最好的是內(nèi)關(guān)、委中、三陰交、人中，其次是尺澤，最次的是非穴。

3 討論

中風(fēng)病是針刺治療的首選適應(yīng)證之一，但是確定最適針刺治療方案還存在許多不確定因素。正確選穴是取得臨床療效的關(guān)鍵之一，臨床上多以“局部選穴，鄰近選穴，遠(yuǎn)端選穴，辨證選穴，隨證選穴”為選穴原則[5]?！靶涯X開竅”針刺法以內(nèi)關(guān)、人中、三陰交為主穴，其中人中為督脈與手足陽明經(jīng)脈會穴，可調(diào)督脈，開竅啟閉，醒腦開竅，寧神定志；內(nèi)關(guān)為八脈交會穴，通陰維脈，有寧心安神、疏通氣血之功；三陰交滋補肝腎。該針法治療中風(fēng)病，療效顯著，實驗研究證實該針法可明顯改善患者血液流變學(xué)[6]，改善微循環(huán)，增加微血管數(shù)[4]，增加腦血流量[7]，提高腦缺血模型大鼠缺血腦組織SOD活性，抑制MDA含量[8]，抑制鈣離子內(nèi)流和炎癥反應(yīng)[9]，調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)遞質(zhì)代謝，促進缺血區(qū)側(cè)枝循環(huán)的建立[10～11]，改善缺血區(qū)軟腦膜微血管自律運動紊亂，改善腦灌流[12]，調(diào)節(jié)腦缺血區(qū)能量代謝，減輕興奮性氨基酸毒性，對抗自由基損傷，減少炎性反應(yīng)[13]，對缺血后腦細(xì)胞有保護作用[14]等。以上實驗大多從分子生物學(xué)角度出發(fā)來研究“醒腦開竅”針法的作用機制，但是效應(yīng)評價指標(biāo)不一，取穴及手法各異，電針參數(shù)不統(tǒng)一，使各個研究的療效不具可比性，沒有形成規(guī)范化的治療方案，而且大樣本隨機對照實驗研究較少見。為此，本研究以大樣本隨機對照法為實驗原則，以腦梗死大鼠模型為載體，以神經(jīng)行為學(xué)評分、微循環(huán)、腦血流量、梗死率、光鏡等為測量指標(biāo)，以均數(shù)加權(quán)法為數(shù)據(jù)處理方法，來評價針刺指標(biāo)對MCAo大鼠模型的針刺效應(yīng)的影響。研究表明：內(nèi)關(guān)穴在降低梗死率、擴張輸入枝管徑、提高神經(jīng)行為學(xué)評分表現(xiàn)的最突出；委中穴在增加腦血流、提高神經(jīng)行為學(xué)方面表現(xiàn)最佳；尺澤穴在增加腦血流、擴張輸出枝管徑、提高正常神經(jīng)細(xì)胞數(shù)方面表現(xiàn)最好；三陰交在減少壞死神經(jīng)細(xì)胞和噬神經(jīng)細(xì)胞、降低壞死神經(jīng)細(xì)胞率、提高神經(jīng)行為學(xué)評分方面表現(xiàn)最優(yōu)。說明針刺治療腦梗死療效確切，針刺治療腦梗死的機制可能是通過改善微循環(huán)、增加微血管數(shù)、增加腦血流量、降低梗死率、降低壞死神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)、減少噬神經(jīng)細(xì)胞數(shù)從而提高神經(jīng)行為學(xué)評分來實現(xiàn)的，為腦梗死的針刺治療方案提供理論依據(jù)。

另外，從本研究的結(jié)果來看，似乎人中穴在腦梗死的針刺治療中所起的作用不是很大，人中穴在臨床與生活中以急救穴抗休克而被大眾所知所用。分析原因可能是所選擇的針刺測量指標(biāo)不全，沒有針對人中穴的測量指標(biāo)，所以今后人中穴治療腦梗死的作用機制也是我們研究的重點。

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Objectives:To eva1uate the inf1uence of acupuncture indexes on the acupuncture effect in the rat mode1s with the midd1e cerebra1 artery occ1usion,by which to pre1iminary exp1ore the mechanism of acupuncture treating cerebra1 infarction,and provides the theoretica1 basis for acupuncture treatment of cerebra1 infarction.Methods:Dup1icated MCAO mode1s by Zea-1onga's thread 1igation assessed by Zausinger's six-point method,and chose rats with 1-3 scores to be grouped.According to the randomized and contro11ed princip1e,rats were divided into basic contro1 groups(inc1uding norma1 group,mode1 contro1 group,mode1 group without intervention)and acupuncture groups[inc1uding Neiguan (PC6)group,Weizhong (BL40)group,Chize (LU5)group,Sanyinjiao (SP6)group,Renzhong(DU6)group and non-acupoint group];in each acupoint or non-acupoint 9 different parameter combinations were respective1y set by orthogona1 intersection method.There were in tota1 60 groups,each group has 12 rats.And the rats were treated by acupuncture with the 1ifting-thrusting manipu1ation every 12 h once,in tota1 6 times.Indexes of neurobehaviora1 scores,cerebra1b1ood f1ow,infarction rate,microcircu1ation,1ight microscope,etc.were measured.In order to eva1uate the inf1uence of acupuncture indexes on the acupuncture effect in rat mode1s with midd1e cerebra1 artery occ1usion(MCAo),on the basis of the add-and-subtract standard deviation of means va1ue from a11 categories in acupuncture group obtained by the app1ication of statistica1 software SPSS17.0,by the norma1 group,mode1 contro1 group,mode1 group without intervention as a reference,a comparison was done;after the c1assified 1eve1s were given the weight coefficients the scores were ca1cu1ated,and then size comparison and sorting were made according to the tota1 scores.Resu1ts:The Neiguan(PC6)group is the most prominent performance in 1owering infarction rate,expanding input branch pipe diameter and improving neurobehaviora1 scores.Weizhong(BL40)group is the best in increasing cerebra1 b1ood f1ow and improving neurobehaviora1 performance.Chize(LU5)group is the best performance in increasing the cerebra1 b1ood f1ow,expanding output branch pipe diameter and increasing the number of norma1 neura1 ce11.Sanyinjiao (SP6)group is the optima1 performance in reducing necrosis of nerve ce11s and neurophags,reducing the necrosis rate of nerve ce11s,and improving neurobehaviora1 scores.Conc1usion:the curative effect of acupuncture treatment for cerebra1 infarction is definite,and its mechanism may be rea1ized through improving microcircu1ation,increasing cerebra1 b1ood f1ow,decreasing the rate of infarction,reducing the number of necrosis of neurons and decreasing the number of neurophags to improve neurobehaviora1 scores,and provide theoretica1 basis for acupuncture treatment for cerebra1 infarction.

Mode1 rats of MCAo,Acupuncture effect,Acupuncture eva1uation,Average weighted c1assified eva1uation

R743.3

B

10.3969/j.issn.1671-4040.2013.08.001

2013-08-15）