胡椒提取物抑菌活性研究

楊 敏，袁佳依，陳文學(xué)

（海南大學(xué)食品學(xué)院，海南海口 570228）

隨著我國居民生活水平的日益提高，人民對(duì)天然防腐劑及其他天然食品添加劑需求的不斷增加，從而促進(jìn)了天然食品添加劑的廣泛應(yīng)用[1]。植物類天然防腐劑是指具有一定的防腐抑菌作用的植物或者植物提取物，而從植物中提取有效抑菌成分已經(jīng)成為研發(fā)天然植物型防腐劑的熱點(diǎn)之一[2]。當(dāng)前，植物被認(rèn)為是化學(xué)合成殺菌劑替代品最好的開發(fā)資源，有人報(bào)道[3]超過1389種植物具有殺菌活性。胡椒自1947年引入中國，目前種植面積超過3萬hm2，年總產(chǎn)量過3萬t，面積和產(chǎn)量世界排名分別是第6位和第5位[4]。胡椒主要含有胡椒堿、胡椒脂堿、胡椒新堿及揮發(fā)油成分。胡椒提取物中含量最大并且活性最高的是胡椒堿。胡椒堿（Piperine）是許多藥理活性的主要化學(xué)物質(zhì)，屬于桂皮酰胺類生物堿[5-7]，研究表明，胡椒醇提取物對(duì)實(shí)驗(yàn)用常見食品污染菌有較強(qiáng)的抑制作用，可用于食品防腐保藏[8]。黑胡椒有強(qiáng)烈芳香和刺激性辣味，還具有除臭、防腐和抗氧化作用，在食品中廣泛使用[9]。馬同鎖等[10]通過對(duì)姜、大蒜、八角茴香、胡椒、辣椒等13種天然香辛料的研究發(fā)現(xiàn)，以辣椒、姜、蒜、胡椒、八角茴香的抑菌作用最為明顯。胡椒的乙醇提取物對(duì)常見食品污染菌有較強(qiáng)的抑制作用；對(duì)來自于口腔中的12種不同屬的176個(gè)細(xì)菌菌株具有較強(qiáng)的抑制作用[11]；胡椒揮發(fā)油對(duì)動(dòng)物和植物病菌、腐敗菌均有抑制效果[12]；徐燕等[13]對(duì)胡椒醇提取的抑菌作用進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，胡椒醇提取物對(duì)實(shí)驗(yàn)用常見食品污染菌有較強(qiáng)的抑制作用。K J Pradhan等[14]研究了青胡椒中的酚類化合物的抑菌作用，發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)對(duì)食品易腐菌、鼠傷沙門氏菌、葡萄球菌、桿菌和大腸桿菌均有抑制作用。本文通過對(duì)胡椒提取物MIC的測定，對(duì)進(jìn)一步研究胡椒抑菌機(jī)理和綜合開發(fā)利用提供一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海南黑胡椒、土豆 市售；大腸桿菌E.Coli、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus、黑曲霉Aspergillus niger、酵母菌Saccharomycetes 海南大學(xué)食品學(xué)院實(shí)驗(yàn)室；乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇 分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；NaCl 分析純，廣州化學(xué)試劑廠；蛋白胨、牛肉浸膏、營養(yǎng)瓊脂粉 生化試劑，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；苯甲酸鈉 食品級(jí)，王龍集體有限公司；山梨酸鉀 食品級(jí)，無錫江大百泰科技有限公司。

SW-CI-IFD潔凈工作臺(tái) 蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司；GI540W自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋 致微儀器有限公司；PL3002電子天平 梅特勒托利多儀器有限公司；SPX智能型生化培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 胡椒提取物的制備 參照陳文學(xué)[15]的提取方法，利用體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液對(duì)胡椒粉末進(jìn)行提取，經(jīng)真空減壓濃縮得到膏狀胡椒提取物，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 不同溶劑萃取物的制備 取胡椒提取物5g，加蒸餾水至約100mL，得到渾濁的懸浮液，轉(zhuǎn)入250mL分液漏斗中，加入100mL石油醚，充分振搖萃取，靜置，待溶液完全分層后，放出上層的石油醚萃取液，剩余的水溶液用同樣的方法再萃取二次，每次分別加入100、50mL石油醚，合并三次石油醚萃取液，在35～40℃下真空減壓回收石油醚，得到石油醚提取物。按相同的方法依次制備氯仿、乙酸乙酯、正丁醇提取物。

1.2.3 配制培養(yǎng)基 按照配制細(xì)菌培養(yǎng)基及真菌培養(yǎng)基的方法[16]配制。

1.2.4 活化菌種 接種完成后，酵母菌置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)48h后拿出，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h后拿出，黑曲霉置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)48h后拿出。

1.2.5 菌懸液的制備 采用MPN計(jì)數(shù)法確定菌懸液濃度，使所用菌懸液濃度保持在105個(gè)/mL。

1.2.6 最低抑菌濃度（MIC）的測定 測定各相黑胡椒提取物及常用防腐劑對(duì)五種常見植物真菌的最低抑菌濃度（MIC）。將乙醇、氯仿、正丁醇、石油醚、乙酸乙酯的提取物及苯甲酸鈉、山梨酸鉀的稀釋濃度均配制為12.5～800mg/mL。為了保持實(shí)驗(yàn)的一致性，把菌懸液按照梯度稀釋法稀釋到同一濃度梯度105個(gè)/mL。在平板中加入2mL提取物溶液，然后加入18mL融化后冷卻到45～60℃的瓊脂培養(yǎng)基并迅速往復(fù)搖動(dòng)和轉(zhuǎn)圈晃動(dòng)5～10s，使培養(yǎng)基與提取液充分混合，使最終濃度為1.25～80mg/mL。以無菌水和乙醇作為對(duì)照，分別記為CK1和CK2。

待培養(yǎng)基冷卻后，用移液槍吸取0.2mL菌液，移入平皿中，均勻涂布。觀察各培養(yǎng)皿的菌種生長情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌懸液MPN測定結(jié)果

根據(jù)1.2.5的方法對(duì)菌懸液MPN進(jìn)行測定，結(jié)果見表1。

表1 五種菌懸液的MPN（個(gè)/mL）Table 1 The MPN values of five kinds of bacteria levitation liquid

由表1可知，大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌及黑曲霉的MPN分別為1.1×107、1.1×106、1.1×107、1.1×107、2.1×107個(gè)/mL。

2.2 各培養(yǎng)皿的生長狀況及最低抑菌濃度

大腸桿菌在各培養(yǎng)基的生長狀況見表2。由表2可知，對(duì)于大腸桿菌，不同的具有防腐作用的物質(zhì)的抑菌效果明顯不同。氯仿相對(duì)大腸桿菌的抑制效果最好，正丁醇相、石油醚相、乙酸乙酯相對(duì)大腸桿菌的抑制效果次之，乙醇相、苯甲酸鈉、山梨酸鉀對(duì)大腸桿菌的抑制效果依次減弱。胡椒的有機(jī)溶劑提取物對(duì)大腸桿菌的抑制效果優(yōu)于常用防腐劑。

枯草芽孢桿菌在各培養(yǎng)基的生長情況如表3所示。由表3可知，對(duì)于枯草芽孢桿菌，不同的具有防腐作用的物質(zhì)的抑菌效果明顯不同。氯仿相對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制效果最好，正丁醇相對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制效果較佳，石油醚相和乙酸乙酯相的抑制效果次之，乙醇相、苯甲酸鈉、山梨酸鉀對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制效果依次減弱。胡椒的有機(jī)溶劑提取物對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制效果均優(yōu)于常用防腐劑。

表2 大腸桿菌在各培養(yǎng)皿的生長狀況Table 2 The growth of E.coli in the culture dishes

表3 枯草芽孢桿菌在各培養(yǎng)皿的生長狀況Table 3 The growth of Bacillus subtilis in the culture dishes

金黃色葡萄球菌各培養(yǎng)基的生長情況如表4所示。由表4可知，對(duì)于金黃色葡萄球菌，不同的具有防腐作用的物質(zhì)的抑菌效果明顯不同。氯仿相對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果最好，正丁醇相、石油醚相的抑制效果較佳，乙酸乙酯相對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果次之，苯甲酸鈉、乙醇相、山梨酸鉀對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果依次減弱。除乙醇提取物外，胡椒的有機(jī)溶劑提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果均優(yōu)于常用防腐劑。

酵母菌在各培養(yǎng)基中的生長情況如表5所示。由表5可知，對(duì)于酵母菌，不同的具有防腐作用的物質(zhì)的抑菌效果明顯不同。氯仿相對(duì)酵母菌的抑制效果最好，正丁醇相對(duì)酵母菌的抑制效果較佳，石油醚相、乙酸乙酯相、苯甲酸鈉的抑制效果次之，而乙醇相、山梨酸鉀對(duì)酵母菌的抑制效果依次減弱。除乙醇相外，胡椒的有機(jī)溶劑提取物對(duì)酵母菌的抑制效果均優(yōu)于常用防腐劑。

黑曲霉在各培養(yǎng)基中的生長情況如表6所示。由表6可知，對(duì)于黑曲霉，不同的具有防腐作用的物質(zhì)的抑菌效果明顯不同。氯仿相對(duì)黑曲霉的抑制效果最好，正丁醇相對(duì)黑曲霉的抑制效果次之，石油醚相、乙酸乙酯相、苯甲酸鈉、山梨酸鉀對(duì)黑曲霉的抑制效果相似，乙醇相對(duì)黑曲霉的抑制效果最弱。除乙醇相外，胡椒的有機(jī)溶劑提取物對(duì)酵母菌的抑制效果均優(yōu)于常用防腐劑。

由表2～表6可知，各相提取物對(duì)這四種菌的最低抑菌濃度如表7所示。

由表7可知，對(duì)于這五種常見菌，具有防腐作用的不同物質(zhì)的抑菌效果明顯不同。從最低抑菌濃度可以得出抑菌效果：對(duì)大腸桿菌的抑菌效果強(qiáng)弱順序依次為：氯仿相＞正丁醇相=石油醚相=乙酸乙酯相＞乙醇相＞苯甲酸鈉＞山梨酸鉀；對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果強(qiáng)弱順序依次為：氯仿相＞正丁醇相=石油醚相=乙酸乙酯相＞苯甲酸鈉＞乙醇相＞山梨酸鉀；對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌效果強(qiáng)弱順序依次為：氯仿相＞正丁醇相＞石油醚相=乙酸乙酯相＞乙醇相=苯甲酸鈉＞山梨酸鉀；對(duì)酵母菌的抑菌效果強(qiáng)弱順序依次為：氯仿相＞正丁醇相＞石油醚相=乙酸乙酯相=苯甲酸鈉＞乙醇相＞山梨酸鉀；而對(duì)黑曲霉的抑菌效果強(qiáng)弱順序依次為：氯仿相＞正丁醇相＞石油醚相=乙酸乙酯相=苯甲酸鈉=山梨酸鉀＞乙醇相?？赡艿脑蛴校哼@五種有機(jī)溶劑對(duì)黑胡椒中抑菌活性物質(zhì)的提取率不同；不同有機(jī)溶劑提取出的極性物質(zhì)不同，從而有不同的抑菌效果。

表4 金黃色葡萄球菌在各培養(yǎng)皿的生長狀況Table 4 The growth of Staphylococcus aureus in the culture dishes

表5 酵母菌在各培養(yǎng)皿的生長狀況Table 5 The growth of yeast in the culture dishes

表6 黑曲霉在各培養(yǎng)皿的生長狀況Table 6 The growth of Aspergillus niger in the culture dishes

表7 各相提取物對(duì)四種菌的MICTable 7 The MICs of four kinds of bacteria with every phase

3 結(jié)論

3.1 五種胡椒提取物和2種防腐劑對(duì)五種菌都有一定的抑菌作用，其中氯仿相的抑菌效果最好，其次是正丁醇相，石油醚相和乙酸乙酯相，而乙醇相、苯甲酸鈉、山梨酸鉀的抑菌效果較弱。胡椒提取物對(duì)5種供試菌均有抑制作用，可見胡椒提取物具有廣譜抑菌性。

3.2 從五種菌懸液的MPN可知：相同條件下，黑曲霉的生長最旺盛，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌的生長能力相似，而枯草芽孢桿菌的生長能力相對(duì)較弱。通過對(duì)G+、G-、酵母菌和黑曲霉的細(xì)胞結(jié)構(gòu)及成分分析，初步推測，胡椒提取物的抑菌效果和菌體的細(xì)胞壁成分有較大關(guān)系。在胡椒提取物的作用下，細(xì)胞壁的通透性可能發(fā)生變化，使胡椒提取物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，達(dá)到抑菌的目的。

3.3 除乙醇相外，胡椒的有機(jī)溶劑提取物的抑菌效果均優(yōu)于常用防腐劑。因此，胡椒提取物作為天然防腐劑成為可能，但是由于提取物成分復(fù)雜，對(duì)其主要作用的成分需要進(jìn)一步探究。

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