富硒酸奶發(fā)酵條件優(yōu)化及貯藏期間理化性質(zhì)研究

張 蓉， 劉 冬， 張 敏， 葉 明

（合肥工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009）

硒具有提高機(jī)體免疫力、清除自由基、延緩衰老、預(yù)防腫瘤和心血管疾病等多種功能［1］。缺硒會(huì)引起克山病、大骨節(jié)病等，在我國(guó)約有300多個(gè)地區(qū)出現(xiàn)缺硒?。?］。天然食物中硒含量普遍較低，通過(guò)人工富集方法將無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒，不但可以提高硒的生理活性和吸收率，同時(shí)可降低無(wú)機(jī)硒的毒副作用［3］。

酸奶具有平衡腸道菌群、防止乳糖不耐癥、降低膽固醇吸收、預(yù)防心血管疾病、提高機(jī)體免疫力及促進(jìn)鈣的吸收等作用。在酸奶中添加植源性功能原料（茶、山核桃等）、微量元素（鉻、鋅）等功能因子［4－7］，可提高酸奶營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和強(qiáng)化酸奶的保健功能。文獻(xiàn)［8］利用保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌共同富硒生產(chǎn)富硒保健酸奶。但利用青春雙歧桿菌和干酪乳桿菌制備富硒酸奶的相關(guān)報(bào)道并不多。雙歧桿菌是機(jī)體腸道中的優(yōu)勢(shì)菌，具有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、改善人體代謝等多種生理作用［9］。干酪乳桿菌耐受有機(jī)體口腔酶類(lèi)、胃酸和膽汁酸等，進(jìn)入人體后可在腸道內(nèi)大量存活，起到調(diào)節(jié)腸內(nèi)菌群平衡、促進(jìn)人體的消化吸收等作用［10］。

本課題組對(duì)青春雙歧桿菌和干酪乳桿菌富硒條件進(jìn)行研究，得到具有良好發(fā)酵性能的富硒發(fā)酵劑［11］，在此基礎(chǔ)上，本文利用富硒青春雙歧桿菌和干酪乳桿菌通過(guò)中心組合試驗(yàn)（CCD）對(duì)富硒酸奶的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)其貯藏期間理化性質(zhì)變化進(jìn)行研究，將酸奶與有機(jī)硒相結(jié)合，更好地發(fā)揮兩者的保健功能。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

菌株為青春雙歧桿菌、干酪乳桿菌，由合肥工業(yè)大學(xué)微生物資源與應(yīng)用研究室從市售酸奶中分離保藏，經(jīng)富硒后得富硒青春雙歧桿菌和干酪乳桿菌［11］；雀巢全脂奶粉，購(gòu)于合肥家樂(lè)福超市；酪蛋白酸鈉、低聚異麥芽糖、亞硒酸鈉等均為食品級(jí)，購(gòu)于鄭州浩力食品添加劑有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

752紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司；Forma 1029厭氧培養(yǎng)系統(tǒng)，美國(guó)Thermo公司；MWCO 3500透析袋，合肥博美科貿(mào)有限公司；SKD－600自動(dòng)凱氏定氮儀，上海沛歐分析儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵劑的制備

將富硒菌種青春雙歧桿菌和干酪乳桿菌混合富硒培養(yǎng)物［11］置于50mL無(wú)菌離心管中，在4℃、10 000r／min條件下冷凍離心10min，用一定體積的10%脫脂復(fù)原乳（108℃滅菌20min）將菌體洗下并調(diào)整至約4×108cfu／mL，即得液態(tài)富硒酸奶發(fā)酵劑。將液態(tài)富硒酸奶發(fā)酵劑置于低溫冰箱（－20℃）預(yù)冷2h，取出置于真空冷凍干燥機(jī)中干燥48h，冷凍溫度－50℃，真空度為20Pa，即得固態(tài)富硒酸奶發(fā)酵劑。

將上述固態(tài)富硒酸奶發(fā)酵劑按2g／L的接種量接于10%脫脂乳培養(yǎng)基中37℃發(fā)酵培養(yǎng)12h，于4℃冰箱中冷藏，即得富硒發(fā)酵劑。

1.3.2 富硒酸奶感官評(píng)價(jià)

由10名具有食品專(zhuān)業(yè)背景的人員組成感官評(píng)定小組，參考凝固型酸牛奶感官評(píng)分表［12］，從滋味、氣味、組織狀態(tài)、色澤進(jìn)行評(píng)價(jià)，匯總評(píng)分。

1.3.3 富硒酸奶主要指標(biāo)的測(cè)定

富硒酸奶主要指標(biāo)參考文獻(xiàn)［13］測(cè)定，脫水收縮值和乳酸菌數(shù)分別參考文獻(xiàn)［14］和文獻(xiàn)［15］進(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。

1.3.4 有機(jī)硒質(zhì)量比測(cè)定

取10g酸乳加入截留分子質(zhì)量為3 500Da透析袋中，并置于去離子水中透析至無(wú)硒析出時(shí)，將酸 奶 在4 ℃、10 000r／min條件 下，離心10min，棄上清液用去離子水洗滌3次，60℃干燥至恒重。參考文獻(xiàn)［16］的方法，以3，3－氨基聯(lián)苯胺比色法［17］測(cè)定硒的質(zhì)量比。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，其結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

亞硒酸鈉添加量選擇40～80μg／kg；接種量選擇體積分?jǐn)?shù)為1.5%～7.5%；發(fā)酵溫度選擇36～44℃；發(fā)酵時(shí)間選擇5～9h，考察各因素對(duì)酸奶感官品質(zhì)和酸度等指標(biāo)的影響。

低聚糖和穩(wěn)定劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)：低聚糖（低聚異麥芽糖、低聚木糖、低聚果糖、大豆低聚糖）按照1%或2%添加，穩(wěn)定劑（酪蛋白酸鈉、海藻酸鈉、果膠）按照0.5%～2.0%添加到12%復(fù)原乳中。于42℃下培養(yǎng)6h，考察低聚糖對(duì)富硒酸奶感官品質(zhì)等的影響。

1.3.6 中心組合試驗(yàn)

依據(jù)單因素試驗(yàn)選擇亞硒酸鈉添加量、接種量及酪蛋白酸鈉進(jìn)行中心組合試驗(yàn)，并做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。用Design Expert 7.0軟件對(duì)中心組合試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行處理，采用F檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 亞硒酸鈉添加量和接種量的確定

不同亞硒酸鈉添加量和接種量下酸奶感官總分和酸度如圖1所示，由圖1a可知，當(dāng)亞硒酸鈉添加量為40～80μg／kg時(shí)，富硒酸奶的感官總分變化不大，該范圍內(nèi)富硒酸奶的感官總分先輕微上升，之后迅速下降，分析原因是當(dāng)亞硒酸鈉添加量大于70μg／kg時(shí)，酸奶顏色微黃，口感發(fā)澀，而造成感官總分急劇下降；富硒酸奶可滴定酸度變化不大，均在77oT左右。為提高富硒酸奶中硒的質(zhì)量比，選擇亞硒酸鈉添加量為60μg／kg，該加硒量符合關(guān)于強(qiáng)化硒的相關(guān)規(guī)定［18］，此時(shí)富硒酸奶呈乳白色，奶香純正，口感細(xì)膩。

由圖1b可看出，接種量為1.5%～4.5%時(shí)，富硒酸奶的感官總分隨接種量的增加而增加，而在4.5%～7.5%范圍內(nèi)感官總分隨接種量的增加呈下降趨勢(shì)。接種量在1.5%～7.5%范圍內(nèi)，酸度隨接種量的增加而增加。為保證富硒酸奶酸甜適當(dāng)，故選擇適宜的接種量為4.5%。

圖1 不同亞硒酸鈉添加量和接種量下酸奶感官總分和酸度

2.2 發(fā)酵溫度和時(shí)間的確定

不同發(fā)酵時(shí)間和溫度下酸奶感官總分和酸度如圖2所示。

由圖2a可看出，發(fā)酵時(shí)間為5～7h時(shí)，感官總分呈增加趨勢(shì)，而后呈下降趨勢(shì)。富硒酸奶的酸度隨發(fā)酵時(shí)間的增加而增加，即發(fā)酵時(shí)間為7h感官總分最大為8.0，此時(shí)富硒酸奶的酸度為76.7oT。由圖2b可看出，發(fā)酵溫度為36～40℃時(shí)，富硒酸奶的感官總分隨發(fā)酵溫度的增加而增加，在40℃時(shí)富硒酸奶的感官總分最高為9.0。發(fā)酵溫度高于40℃時(shí)，感官總分隨發(fā)酵溫度的增加而快速下降。發(fā)酵溫度為36～42℃，富硒酸奶的酸度呈增加趨勢(shì)，而高于42℃時(shí)酸度緩慢下降，可能是過(guò)高的溫度（44℃）抑制了富硒酸奶發(fā)酵劑的活力。

圖2 不同發(fā)酵時(shí)間和溫度下酸奶感官總分和酸度

2.3 低聚糖種類(lèi)及其添加量的確定

不同低聚糖及其添加量下的感官總分如圖3所示。從圖3可看出，在添加5%蔗糖的基礎(chǔ)上，分別添加1%或2%的低聚異麥芽糖、低聚果糖、低聚木糖和大豆低聚糖，以1%的低聚異麥芽糖和5%蔗糖混合添加到復(fù)原乳中，發(fā)酵制備的富硒酸奶酸甜適中，感官總分最高為8.7。

圖3 不同低聚糖及其添加量下的感官總分

2.4 穩(wěn)定劑種類(lèi)及其添加量的確定

穩(wěn)定劑對(duì)酸奶感官總分和脫水收縮值的影響如圖4所示，由圖4可看出，當(dāng)果膠的添加量大于0.5%時(shí)，隨其添加量的增加富硒酸奶的感官總分呈下降趨，而脫水收縮值呈上升趨勢(shì)。相比于0.5%的果膠，添加1%的海藻酸鈉的富硒感官總分較低，且每100g脫水收縮量為20.6g。而添加1%的酪蛋白酸納，富硒酸奶凝乳完全、無(wú)乳清析出、呈乳白色、口感黏稠細(xì)膩，感官總分最高約8.5。此外，酪蛋白酸鈉的添加還可以提高富硒酸奶中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，所以選擇1%的酪蛋白酸鈉作為穩(wěn)定劑。

圖4 穩(wěn)定劑對(duì)酸奶感官總分和脫水收縮值的影響

2.5 中心組合試驗(yàn)

依據(jù)單因素試驗(yàn)選擇亞硒酸鈉、接種量及酪蛋白酸鈉進(jìn)行中心組合試驗(yàn)，因素水平見(jiàn)表1所列。利用Design Expert 7.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，其結(jié)果及感官評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表2所列。

二次多項(xiàng)式模型回歸系數(shù)估計(jì)和試驗(yàn)結(jié)果方差分析結(jié)果見(jiàn)表3所列，對(duì)菌體含硒量的影響程度從大到小依次為B＞A＞C，即接種量＞亞硒酸鈉＞酪蛋白酸鈉，回歸方程為：

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)的因素水平表

表２ 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

根據(jù)回歸方程可得3因素交互作用響應(yīng)面，如圖5所示。由圖5可知，隨著接種量的增加，富硒酸奶的感官總分呈先增加后減少的趨勢(shì)。類(lèi)似地隨亞硒酸鈉和酪蛋白酸鈉添加量的增加，富硒酸奶的感官總分也呈同樣的趨勢(shì)?；貧w方程存在最大值點(diǎn)，利用方程計(jì)算得感官總分最大為8.88，此時(shí)接種量為4.54%，亞硒酸鈉添加量為61.76μg／kg，酪蛋白酸鈉添加量為1.4%。

表3 二次多項(xiàng)式模型回歸系數(shù)估計(jì)和試驗(yàn)結(jié)果方差分析結(jié)果

圖5 3因素交互作用響應(yīng)面

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

在上述最優(yōu)條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，富硒酸奶凝乳完全，呈乳白色，有光澤，具有酸奶固有滋味和香味，酸甜協(xié)調(diào)，組織均勻細(xì)膩，無(wú)乳清析出，無(wú)氣泡和裂紋，感官總分為9.1，略高于回歸方程所得的預(yù)測(cè)值（感官總分約為8.9）。此外，富硒酸奶中有機(jī)硒質(zhì)量比為29.2μg／kg。

2.7 富硒酸奶貯藏期間理化指標(biāo)變化

25d貯藏期內(nèi)，富硒酸奶中的蛋白質(zhì)和脂肪含量呈下降趨勢(shì)，仍符合文獻(xiàn)［13］相關(guān)規(guī)定。脫水收縮值在1～25d內(nèi)呈增加趨勢(shì)，與文獻(xiàn)［19］結(jié)果一致。非脂乳固體在第25天時(shí)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.2%，較第1天減少了0.9%。pH值呈緩慢下降趨勢(shì)，可能是乳酸菌繼續(xù)代謝產(chǎn)酸所致。乳酸菌數(shù)也隨儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，但在第25天時(shí)乳酸菌總數(shù)為2.88×107cfu／mL，仍符合GB 19302關(guān)于乳酸菌的規(guī)定（≥1×106cfu／mL）。此外，富硒酸奶中有機(jī)硒的質(zhì)量比在第1天和第25天分別為30.1μg／kg和29.8μg／kg，可見(jiàn)有機(jī)硒的質(zhì)量比相對(duì)穩(wěn)定。具體結(jié)果見(jiàn)表4所列。

表4 貯藏期間富硒酸奶理化性質(zhì)和乳酸菌數(shù)的變化

3 討 論

本文選用經(jīng)過(guò)富集硒的青春雙歧桿菌和干酪乳桿菌進(jìn)行混合發(fā)酵制備酸奶，并添加1%低聚異麥芽糖作為益生因子，通過(guò)CCD試驗(yàn)獲得其最佳發(fā)酵條件如下：奶粉添加量為12%、蔗糖添加量為5%、低聚異麥芽糖添加量為1%、亞硒酸鈉添加量為 61.8μg／kg、酪蛋白酸鈉添加量為1.4%，接種量為4.5%、發(fā)酵溫度為40℃、發(fā)酵時(shí)間為7h，由此制備得一種新型富硒酸奶。該富硒酸奶感官總分為9.1，有機(jī)硒質(zhì)量比為29.2μg／kg。在25d、4℃貯藏期間內(nèi)富硒酸奶的蛋白質(zhì)、脂肪、脫水收縮值、非脂乳固體和pH值等理化指標(biāo)均符合文獻(xiàn)［13］的相關(guān)規(guī)定，且在第25天活菌數(shù)仍達(dá)到2.88×107cfu／mL，高于關(guān)于乳酸菌數(shù)的規(guī)定（≥1×106cfu／mL），由此可以延長(zhǎng)富硒酸奶的貨架期。與普通酸奶相比，富硒酸奶除具有酸奶的保健功能外，其中富含的有機(jī)硒還可以補(bǔ)充人體所需的硒元素，減少缺硒病的發(fā)生，且其中富含的青春雙歧桿菌和干酪乳桿菌比一般乳酸菌更易在腸道定植，增加腸道有益菌，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，維持機(jī)體健康［9－10］。

［1］齊睿婷，顏炳祥，潘道東，等.乳酸乳球菌富硒及其硒多糖抗氧化活性研究［J］.食品工業(yè)科技，2012，33（11）：69－70.

［2］靳志強(qiáng)，張博文，李平蘭.動(dòng)物雙歧桿菌01耐硒性能及富硒條件的研究［J］.食品科學(xué)，2009，30（15）：184－187.

［3］陳尚衛(wèi)，戴 軍，吳勝芳，等.富硒酵母中硒蛋氨酸的GCMS／MS測(cè)定［J］.食品與機(jī)械，2012，28（2）：60－62.

［4］Aryana K J，McGrew P.Quality attributes of yogurt with Lactobacillus casei and various prebiotics［J］.LWT－Food Science and Technology，2007，40（10）：1808－1814.

［5］Ye M，Liu D，Zhang R，et al.Effect of hawk tea （Litsea coreana L.）on the numbers of lactic acid bacteria and flavour compounds of yogurt［J］.International Dairy Journal，2012，23（1）：68－71.

［6］Ye M，Ren L，Wu Y N，et al.Quality characteristics and antioxidant activity of hickory－black soybean yogurt［J］.LWT－Food Science and Technology，2013，51 （1）：314－318.

［7］劉 穎，蔣寶泉，孫海嵐.富鉻復(fù)合營(yíng)養(yǎng)酸奶對(duì)糖尿病大鼠降血糖效應(yīng)的研究［J］.腸外與腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)，2007，14（2）：87－90.

［8］黃高明.富硒保健酸奶的研制［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊，2010（2）：42－44.

［9］劉 韓，關(guān) 宏，楊文欽，等.青春雙歧桿菌凝固型酸奶研制及選擇性培養(yǎng)基比較［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，42（5）：36－40.

［10］肖琳琳，董明盛.干酪乳桿菌KM－1的篩選及其降膽固醇活性研究［J］.中國(guó)乳品工業(yè)，2006，31（6）：7－10.

［11］劉 冬，葉 明，葉玉娥，等.富硒酸奶發(fā)酵劑的制備及其發(fā)酵性能研究［J］.食品科學(xué)，2011，32（6）：76－79.

［12］生慶海，張海霞，馬 蕊.乳與乳制品感官品評(píng)［M］.北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，2009：74－77.

［13］GB 19302－2010，食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 發(fā)酵乳［S］.

［14］Sarkar S.Effect of probiotics on biotechnological characteristics of yoghurt：a review［J］.British Food Journal，2008，110（7）：717－740.

［15］Tabasco R，Paarup T，Janer C，et al.Selective enumeration and identification of mixed cultures of Streptococcus thermophilus，Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus，L.acidophilus，L.paracasei subsp.paracasei and BifidobacteriuMlactis in fermented milk［J］.International Dairy Journal，2007，17（9）：1107－1114.

［16］Sánchez－Segarra P J，García－Martínez M，Gordillo－Otero MJ，et al.Influence of the addition of fruit on the mineral content of yoghurts：nutritional assessment［J］.Food Chemistry，2000，71（1）：85－89.

［17］宋照軍.乳酸菌富硒技術(shù)初步研究［J］.食品科學(xué)，2004，25（9）：137－140.

［18］GB 14880－2009，食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)［S］.

［19］Wang J C，Guo Z，Zhang Q，et al.Effect of probiotic Lactobacillus casei Zhang on fermentation characteristics of set yogurt［J］.International Journal of Dairy Technology，2010，63（1）：105－112.