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    小鼠肥大細(xì)胞蛋白酶4的原核表達(dá)和多克隆抗體制備

    2013-09-03 08:22:26璐,
    關(guān)鍵詞:糜蛋白酶肥大細(xì)胞效價(jià)

    劉 璐, 劉 健

    (合肥工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院,安徽 合肥 230009)

    肥大細(xì)胞在人體內(nèi)參與傷口愈合、血管發(fā)生、天然免疫和獲得性免疫,目前研究表明,肥大細(xì)胞在多發(fā)性硬化、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、主動(dòng)脈瘤、癌癥以及飲食導(dǎo)致的肥胖和糖尿病等疾病中起重要作用[1]。成熟的肥大細(xì)胞通過脫顆粒分泌大量生物活性物質(zhì),包括生物胺類(如組胺和血清素)、細(xì)胞因子(如腫瘤壞死因子等)、絲甘蛋白聚糖、多種溶酶體酶和一系列特異的肥大細(xì)胞蛋白酶(mast cell protease,簡稱MCP,如類糜蛋白酶、類胰蛋白酶、羧肽酶A)。當(dāng)肥大細(xì)胞被誘導(dǎo)脫顆粒,這些介質(zhì)就會(huì)隨之釋放,其中MCP占肥大細(xì)胞分泌蛋白總量25%以上。

    在這些MCP中,類糜蛋白酶能誘導(dǎo)嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞聚集[2],從而引起微血管通透性增強(qiáng)[3],通過選擇性酶解基質(zhì)蛋白,激活蛋白酶受體,激活基質(zhì)金屬蛋白酶促進(jìn)組織重建[4],在過敏性疾?。ㄈ缦⑻貞?yīng)性皮炎等)炎癥發(fā)生發(fā)展中起促進(jìn)作用[5-6],并與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7]。在小鼠體內(nèi),肥大細(xì)胞表達(dá)多種類糜蛋白酶(mMCP-1,mMCP-2,mMCP-4,mMCP-5,mMCP-9),mMCP-4的底物特異性高度相似于人的類糜蛋白酶,并且在小鼠體內(nèi)組織的分布和人體類糜蛋白酶相似,所以小鼠mMCP-4可認(rèn)為是最接近人體類糜蛋白酶的同系物,可以用mMCP-4在小鼠體內(nèi)的作用推斷人體類糜蛋白酶的相關(guān)作用[8]。

    為進(jìn)一步研究mMCP-4的生物學(xué)活性及其與各種疾病的關(guān)系,本文將mMCP-4克隆到原核表達(dá)載體pET28a,利用大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)獲得重組蛋白mMCP-4。使用純化后的重組蛋白免疫兔子,制備mMCP-4多克隆抗體,并對(duì)獲得的多克隆抗體的效價(jià)和專一性進(jìn)行鑒定和分析。

    1 材料與方法

    1.1 材料與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    刀豆素、PEG8000、弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑購自SIGMA公司;蛋白定量試劑盒、氯仿、異丙醇、乙醇購自國藥公司;RNAiso Plus、RT-PCR試劑盒、BamH I和Xho I限制性內(nèi)切酶、Solution I連接酶購自TAKARA公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Invitrogen公司;IPTG購自上海生工公司;羊抗兔IgG-HRP購自 KPI公司;AxyPrepTMDNA Gel Extraction Kit、AxyPrepTMPlasmid Miniprep Kit購自AXYGEN公司;RPMI MediuM1640購自Gibco公司;Ni SepharoseTMHigh Performance購自GE公司;HRP-DAB顯色試劑盒、Super Singnal West Pico化學(xué)發(fā)光底物購自Thermo公司;感受態(tài)JM109、大腸桿菌BL21(DE3)、質(zhì)粒pET28a由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

    C57BL/6小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,新西蘭大白兔購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

    1.2 方法

    1.2.1 脾細(xì)胞及小鼠cDNA的制備

    取健康8周大C57BL/6小鼠的脾細(xì)胞,用RPMI1640培養(yǎng)基(含有10%FBS,1%雙抗,25mg/L刀豆素)37℃培養(yǎng)24h。根據(jù)總RNA提取試劑盒提取刀豆素刺激后的脾細(xì)胞總RNA,以O(shè)ligo d(T)18Primers為引物,M-MLV為逆轉(zhuǎn)錄酶,合成小鼠cDNA,置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

    根據(jù)GenBank發(fā)表的小鼠 MCP-4mRNA序列(登錄號(hào)為NM-010779)設(shè)計(jì)嵌套引物,預(yù)期擴(kuò)增長度為709bp。

    正義引物為:

    反義引物為:

    分別在引物P2、P3兩端加入BamH I和Xho I的酶切位點(diǎn)。

    1.2.3 PCR擴(kuò)增 mMCP-4

    獲得的cDNA 0.2μL,10×PCR Buffer 2.5μL,引物P1(10μmol/L)和P3(10μmol/L)各1μL,2.5mmol/L dNTP 2.5μL,Taq DNA Polymerase 0.2μL,加DW 補(bǔ)至25μL,混勻。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5min,94℃30s,54℃30s,72℃1min,30個(gè)循環(huán),72℃延伸10min,得到一次PCR產(chǎn)物。

    一次PCR產(chǎn)物1μL,10×PCR Buffer 5μL,引物P2(10μmol/L)和P3(10μmol/L)各2μL,2.5mmol/L dNTP 4μL,Taq DNA Polymerase 0.4μL,加DW補(bǔ)至50μL,混勻。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5min,94℃30s,60℃30s,72℃1min,30個(gè)循環(huán),72℃延伸10min,得到二次PCR產(chǎn)物。

    1.2.4 構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a-mMCP-4

    凝膠回收試劑盒(AxyPrepTMDNA Gel Extraction Kit)回收二次PCR產(chǎn)物并計(jì)算其質(zhì)量濃度。用BamH I和XhoI限制性內(nèi)切酶對(duì)膠回收產(chǎn)物和質(zhì)粒pET28a進(jìn)行酶切,37℃放置3~4h。膠回收酶切好的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pET28a,16℃連接過夜。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞JM109,把染化后的菌液涂在含有卡拉霉素(Ka-na)抗性的培養(yǎng)板上,37℃過夜。RT-PCR和雙酶切鑒定獲得重組質(zhì)粒pET28a-mMCP-4,送Invitrogen公司進(jìn)行測序獲得陽性克?。?]。

    1.2.5 mMCP-4融合蛋白的表達(dá)及純化

    重組質(zhì)粒pET28a-mMCP-4轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,挑陽性菌落接入到3mL含有Kana(30μg/mL)的LB培養(yǎng)基中,200r/min,37℃培養(yǎng)過夜。第2天,將菌液按1∶100的比例接入3mL含有Kana(30μg/mL)的LB培養(yǎng)基,進(jìn)行小規(guī)模誘導(dǎo),37℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期,按1∶1 000向其中加入0.8mol/L的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)4~6h。分別取相當(dāng)于0.2OD550的菌液,離心后重懸于SDS-PAGE上樣緩沖液中,100℃煮沸變性10min,進(jìn)行SDSPAGE電泳檢測mMCP-4是否表達(dá)。小規(guī)模誘導(dǎo)檢測重組質(zhì)粒pET28a-mMCP-4在BL21中成功表達(dá)后,大規(guī)模誘導(dǎo),菌液4℃12 000g離心后重懸于pH值為7.4的Tris-HCl,超聲破碎菌液,工作5s,間歇15s,重復(fù)40次,4℃12 000g離心20min,棄上清。將沉淀用Tris-HCl洗3次,沉淀 重 懸 于 裂 解 液 (50mmol/L Tris-HCl,0.3mol/LNaCl,6mol/L尿素,5mmol/L咪唑,pH值為7.4)中,4℃保存過夜。裂解液4℃12 000g離心30min,取上清液用過濾器過濾后,用Ni親和層析柱純化蛋白,SDS-PAGE檢測。

    1.2.6 兔抗mMCP-4抗體的制備及效價(jià)測定

    純化好的重組蛋白(約1mg)與弗氏完全佐劑按照1∶1的體積比混勻,進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射。14d后以等量蛋白和等體積弗氏不完全佐劑加強(qiáng)免疫,后每2周加強(qiáng)1次。第4次加強(qiáng)免疫10d后,在兔子耳緣靜脈取血0.5~1mL,分離抗血清[10]。用純化的 mMCP-4重組蛋白包被ELISA反應(yīng)板,利用ELISA法測定抗體效價(jià),其中一抗為倍比稀釋的免疫后兔血清,陰性對(duì)照為免疫前兔血清。效價(jià)達(dá)到1∶100 000以上時(shí),經(jīng)頸動(dòng)脈放血,收集血清,分裝后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.7 western blot檢測抗體特異性

    提取小鼠腹膜肥大細(xì)胞總蛋白,經(jīng)SDSPAGE電泳分離后,電轉(zhuǎn)移至PVDF膜,4℃封閉過夜,一抗為制備的兔抗血清(1∶5 000),37℃反應(yīng)1h,PBST洗5次,每次5min,二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記(HRP)的羊抗兔抗體(1∶3 000),37℃反應(yīng)1h,PBST洗5次,每次5min。加化學(xué)發(fā)光底物反應(yīng)后拍照[11]。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 pET28a-mMCP-4的構(gòu)建

    以小鼠脾細(xì)胞cDNA為模板,通過RT-PCR擴(kuò)增目的基因 mMCP-4(709bp),將其重組入表達(dá)載體pET28a后,轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM109。重組質(zhì)粒RT-PCR和BamH I、Xho I雙酶切鑒定結(jié)果如圖1所示。

    圖1中,M為DNA標(biāo)記;1代表BamH I、XhoI雙酶切重組質(zhì)粒;2代表重組質(zhì)粒經(jīng)RTPCR鑒定的目的條帶。

    從圖1可看出,第1泳道和第2泳道均出現(xiàn)約700bp的預(yù)期片段,說明獲得重組質(zhì)粒。將酶切鑒定正確的質(zhì)粒送去測序,序列正確的重組質(zhì)粒命名為pET8a-mMCP-4。

    圖1 重組質(zhì)粒的雙酶切和RT-PCR鑒定

    2.2 融合蛋白的表達(dá)與純化

    構(gòu)建的重組表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)化為大腸桿菌BL21后,挑取單菌落搖菌,菌液按1∶100接種于LB培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)加IPTG誘導(dǎo),收集未誘導(dǎo)和分別誘導(dǎo)2、4、6h后的菌液樣品,SDS-PAGE電泳檢測如圖2所示。

    圖2a中,M為蛋白標(biāo)記;1代表未誘導(dǎo);2~4分別代表加IPTG誘導(dǎo)2、4、6h;圖2b中,M為蛋白標(biāo)記;1代表純化的mMCP-4重組蛋白;2代表破碎后沉淀;3代表表達(dá)細(xì)菌總蛋白。

    從圖2可以看出,檢測泳道與對(duì)照泳道相比,泳道2、3、4都出現(xiàn)與預(yù)期28.7kDa大致相符的特異性條帶,且在4h時(shí)表達(dá)量最大。表達(dá)的重組蛋白主要以包涵體形式存在于超聲破碎后的沉淀中,將包涵體溶于裂解液中,通過Ni親和層析柱分離,最終獲得用于抗體制備的重組蛋白mMCP-4。

    圖2 重組蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)情況及其純化

    2.3 ELISA法檢測抗血清效價(jià)

    每孔用2pmol/L的mMCP-4重組蛋白作為抗原包被酶標(biāo)板,2%脫脂奶粉封閉,將抗血清按1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000、1∶256 000稀釋后加入酶標(biāo)板孵育。洗滌后加入HRP標(biāo)記的羊抗兔為二抗,最后以四甲基聯(lián)苯胺(TMB)為底物,顯色后測定450nm波長的吸光度。以免疫前血清為對(duì)照,每個(gè)稀釋度重復(fù)3次,免疫后血清吸光度與免疫前血清吸光度的比值大于2.1,且免疫后血清吸光度大于0.4為陽性。mMCP-4抗體ELISA效價(jià)如圖3所示。圖3表明,制備的抗血清效價(jià)達(dá)1∶128 000。

    圖3 mMCP-4抗體ELISA效價(jià)

    2.4 western blot檢測

    為檢測制備的抗血清特異性,提取小鼠腹膜肥大細(xì)胞蛋白進(jìn)行western blot檢測,其檢測結(jié)果如圖4所示,圖4中,1、2為小鼠腹膜肥大細(xì)胞;3、4為小鼠肝癌細(xì)胞H22。以小鼠肝癌細(xì)胞H22作為陰性對(duì)照,制備的兔抗血清為一抗,HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體為二抗。由圖4可知,抗血清能識(shí)別小鼠腹膜肥大細(xì)胞中的蛋白,而在肝癌細(xì)胞H22中無明顯反應(yīng),說明所制備的抗體具有較好的特異性。

    圖4 western blot檢測抗血清特異性

    3 討 論

    目前,外源蛋白的表達(dá)系統(tǒng)有很多,其中大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有培養(yǎng)方便、操作簡單、成本低廉、表達(dá)量大、易于純化及易于工業(yè)化批量生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)中刀豆素誘導(dǎo)鼠脾細(xì)胞能表達(dá)較高水平的mMCP-4,通過RT-PCR擴(kuò)增出目的基因,通過BamH I和Xho I切點(diǎn)整合入pET28a質(zhì)粒,成功構(gòu)建重組表達(dá)載體pET28a-mMCP-4,然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)BL21表達(dá)融合蛋白,超聲破碎后,通過SDS-PAGE鑒定在28.7kDa處有明顯的特異蛋白條帶,利用Ni親和層析柱純化含有his-tag的mMCP-4蛋白。

    制備抗體需要獲得高純度的目的蛋白,本研究以純化的重組蛋白mMCP-4作為抗原,既可提高抗原的純度,也使其制備抗體時(shí)有較高的免疫原性,且選用了免疫周期長、少量多次免疫兔子,更有利于制備高特異性、高效價(jià)的mMCP-4多克隆抗體。獲得的兔抗血清,ELISA測其效價(jià)達(dá)1∶128 000。提取小鼠腹膜肥大細(xì)胞總蛋白進(jìn)行western blot檢測mMCP-4多克隆抗體的專一性,結(jié)果只出現(xiàn)一條特異性條帶,說明制備的多克隆抗體具有較好的特異性。

    人肥大細(xì)胞分泌的類糜蛋白在多種疾病中起重要作用,研究表明,它是變態(tài)反應(yīng)性疾病和心血管疾病一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。在小鼠體內(nèi)通過缺失MCP-4產(chǎn)生 MCP-4-/-小鼠,證明 mMCP-4在過敏性器官反應(yīng)中能中和肥大細(xì)胞的有害作用[12],并且mMCP-4缺失后小鼠腹主動(dòng)脈瘤形成受到抑制[13]。本實(shí)驗(yàn)mMCP-4重組蛋白的成功表達(dá)及其多克隆抗體的制備,為建立較方便的免疫學(xué)檢測方法及探求mMCP-4在鼠體內(nèi)的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

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