響應面法優(yōu)化深黃被孢霉發(fā)酵生產花生四烯酸的培養(yǎng)基條件

于新新，于長青

（黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江大慶163319）

花生四烯酸（Arachidoni acid，簡稱AA或ARA）屬于ω-6系列多價不飽和脂肪酸，是人體前列腺素合成的重要前體物質[1]。研究發(fā)現(xiàn)，花生四烯酸已在醫(yī)藥、食品、化妝品等領域得到了廣泛的應用[2-3]。利用微生物發(fā)酵法生產花生四烯酸具有不受原材料和氣候限制、生產周期短、成本較低、產物含量高、分離提取容易等特點，因此受到了國內外的重視，加拿大、日本等國家在這一方面研究的較早較多[4-5]，已經實現(xiàn)了工業(yè)化生產，而我國尚處于起步階段。最近很多學者嘗試添加外源油脂、花生餅粉等復合氮源來提高ARA的產量，但是這不能從根本上解決成本問題[6-7]。玉米黃漿水主要來自玉米淀粉糖工業(yè)，含有大量的玉米蛋白和少量的玉米淀粉，是一種便宜易得的原料。在發(fā)酵的培養(yǎng)基中添加一定量的玉米黃漿水可以達到降低發(fā)酵成本的目的，同時對發(fā)酵產物的產量無顯著性影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花生四烯酸菌種 深黃被孢霉YZ-124，本實驗室篩選、分離、保藏，菌種于PDA斜面保存，每3個月轉接一次；斜面培養(yǎng)基 選用成品PDA培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基 葡萄糖10%，磷酸二氫鉀0.1%，硫酸鎂0.3%，酵母膏0.2%，硫酸銨0.2%，pH6.0，121℃滅菌20min；產脂培養(yǎng)基 葡萄糖10%，磷酸二氫鉀0.2%，硫酸鎂0.05%，酵母膏0.2%，檸檬酸鈉0.2%，pH6.0，121℃滅菌20min。

BCN-1360型超級潔凈工作臺、HGCE-F160型恒溫振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司；GC9900型氣相色譜儀 上?？苿?chuàng)色譜儀器有限公司；JD100-3B型電子分析天平 沈陽龍騰電子有限公司；10L全自動發(fā)酵罐 上海森信實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

1.2.1.1 搖瓶培養(yǎng) 菌種在斜面培養(yǎng)基上于28℃培養(yǎng)7d，待孢子大量轉變?yōu)榛疑螅?℃冰箱保存。取5mL無菌水洗下孢子，然后注入裝有100mL種子基本培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，分別添加0、25%、50%、75%比例的玉米黃漿水（玉米黃漿水與種子培養(yǎng)基的體積比），溫度為28℃，轉速180r/min振蕩培養(yǎng)2d。

1.2.1.2 發(fā)酵罐培養(yǎng) 待種子長好后按20%的接種量接種到發(fā)酵罐中，然后分別添加0、25%、50%、75%比例的玉米黃漿水（玉米黃漿水與種子基本培養(yǎng)基的體積比）。10L罐裝入6L發(fā)酵液，通氣量為3VVM，攪拌速度為180r/min，培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)7d。

1.2.2 分析方法

1.2.2.1 菌體生物量的測定 將培養(yǎng)了7d的發(fā)酵罐內的菌體取出來進行分組離心，去上清液，再用蒸餾水洗滌2～3次，取沉淀物，放入75℃的烘箱中烘干至恒重，測得菌體的生物量（干重）。

1.2.2.2 油脂的提取測定 將干菌體用研磨器研成粉末后用索氏提取法提取，有機溶劑選擇乙醚，在80℃下提取6h，最后回收乙醚，100℃下干燥至恒重[8－9]。

1.2.2.3 氣相色譜分析花生四烯酸 待測樣品的處理：取0.3g的油脂放入15mL刻度試管中，按每克油脂加入15mL 0.5mol/L KOH－CH3OH溶液，65℃水浴加熱水解40min，冷卻后按每克油脂加入15mL 14%BF3－CH3OH溶液，水浴加熱5min甲酯化，冷卻后向試管中加入正己烷1.5mL，充分振蕩，加入去離子水，振蕩靜止分層，取上層清液0.5μL進行氣相色譜分析[2]。

氣相色譜分析條件：上?？苿?chuàng)色譜儀器有限公司提供的GC9900型氣相色譜儀；色譜柱：FFAP交聯(lián)石英毛細管柱；檢測器：FID；載氣：氮氣（70mL/min）；溫度：進樣口溫度160℃，檢測器溫度240℃；柱溫：160℃升至200℃（8℃/min），恒溫7min，降至160℃（2℃/min）；進樣量：0.5μL。

1.2.3 培養(yǎng)基條件的優(yōu)化 在單因素實驗的基礎上，以葡萄糖濃度（X1）、玉米黃漿水量（X2）、pH（X3）為自變量，花生四烯酸產量為響應值，采用中心組合實驗設計的二次回歸方程實驗擬合自變量和花生四烯酸產量之間的函數(shù)關系。采用響應面分析法優(yōu)化發(fā)酵生產的培養(yǎng)基。實驗因素水平及編碼見表1。

表1 實驗因素水平及編碼Table 1 The level and coding of experimental factors

2 結果與分析

2.1 葡萄糖濃度對發(fā)酵產物的影響

本文研究了葡萄糖濃度對深黃被孢霉YZ－124產花生四烯酸的影響，結果如圖1。

從圖1可以看出，隨著葡萄糖量的增加，菌體、油脂量及花生四烯酸產量均增加，但當糖濃度大于90g/L時菌體量開始下降，這可能是由于隨著葡萄糖濃度的升高，碳源增加，相應的碳氮比值變大，導致培養(yǎng)基的滲透壓升高，從而影響了微生物的生長，進而影響菌絲的生長，其相應的發(fā)酵產物產量必然降低，因此對本實驗而言，葡萄糖濃度應該保持在90g/L左右比較理想。

圖1 不同葡萄糖濃度對發(fā)酵產物的影響Fig.1 Effect of different glucose concentrations on fermentation product

2.2 玉米黃漿水添加量對發(fā)酵產物的影響

玉米黃漿水接種量對發(fā)酵產物的影響，結果如圖2。

圖2 不同玉米黃漿水的添加量對發(fā)酵產物的影響Fig.2 Effect of different addition of waste water from maize paste on fermentation product

從圖2可以得知，隨著玉米黃漿水添加比例的不斷增大，生物量、油脂量及ARA產量均出現(xiàn)先增加后降低的趨勢，這主要是由于玉米黃漿水中淀粉含量較少，若大量添加到培養(yǎng)基中，造成培養(yǎng)基中可直接利用的碳源減少，導致三者產量下降；同時發(fā)酵時間也明顯延長，在工業(yè)化生產中不利于降低發(fā)酵成本。因此，玉米黃漿水與基本培養(yǎng)基的體積比為25%時為最佳培養(yǎng)條件。

2.3 初始pH對發(fā)酵產物的影響

本實驗調整培養(yǎng)基的初始pH分別為5、6、7、8對深黃被孢霉YZ－124進行發(fā)酵培養(yǎng)，研究不同初始pH對發(fā)酵造成的影響，結果如圖3。

從圖3可以看出，發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH對該菌株的細胞生長、產油脂和花生四烯酸產量都有較大的影響，當初始pH為6時，菌體的各種發(fā)酵產物含量達到最大，隨著pH的繼續(xù)增加，各項指標下降較明顯。對于深黃被孢霉來說，較低的pH有利于油脂的積累[6]，對ARA在油脂中含量的增加也有促進作用，綜合實驗考慮，本實驗選用pH6作為發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳pH。

圖3 不同的初始pH對發(fā)酵產物的影響Fig.3 Effect of different initial pH on fermentation product

2.4 回歸模型的建立及分析

2.4.1 模型的建立 按照二次回歸方程實驗設計方案進行實驗。實驗設計條件及結果見表2。

表2 實驗設計條件及結果Table 2 The result and condition of experiment

應用Design Expert 7.1軟件，對表2中的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，可得葡萄糖濃度（X1）、玉米黃漿水添加量（X2）、初始pH（X3）與ARA產量的二次多項回歸方程：ARA產量=3.08＋0.14X1－0.049X2＋0.081X3－0.012X1X2－0.14X1X3＋0.11X2X3－0.15－0.13X22－0.13。對模型進行方差分析，結果見表3。

由表3可以看出，ARA產量的失擬值大于0.05，這說明其他因素對實驗結果干擾較小，模型能較好的反映數(shù)據(jù)；而ARA產量的p＜0.05，這說明方程與實際情況擬合良好，能夠反映ARA產量與葡萄糖濃度、玉米黃漿水的添加量、初始pH之間的關系，同時模型的相關系數(shù)R2=0.9456，說明94.56%的變化可以通過該模型解釋，因此可以利用此模型對培養(yǎng)基對ARA產量的影響進行分析和預測。

2.4.2 優(yōu)化的響應面實驗分析 應用Design Expert 7.1分析軟件可得到三個影響因子之間的響應面分析圖，葡萄糖濃度、玉米黃漿水添加量、初始pH對ARA產量的影響。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

在初始pH為6時，玉米黃漿水添加量（X2）和葡萄糖濃度（X1）對ARA產量的影響的響應面見圖4。

圖4 玉米黃漿水添加量和葡萄糖濃度對ARA產量影響的響應面Fig.4 Response surface of effect of waste water from maize paste adding and glucose concentrations on ARA production

由圖4可知，當葡萄糖濃度從80g/L到90g/L，玉米黃漿水添加量從0到25%時，ARA產量隨二者的增加而升高；葡萄糖濃度從90g/L到100g/L，玉米黃漿水添加量從25%到50%時，ARA產量隨二者的增加而下降。結果表明，當葡萄糖濃度為90g/L、玉米黃漿水添加量為25%時，ARA產量達到最大。

在葡萄糖濃度為90g/L時，玉米黃漿水添加量（X2）和初始pH（X3）對ARA產量的影響的響應面見圖5。

圖5 玉米黃漿水添加量和初始pH對ARA產量影響的響應面Fig.5 Response surface of effect of waste water from maize paste adding and initial pH on ARA production

由圖5可知，當玉米黃漿水添加量從0到25%，初始pH從5到6時，ARA產量隨二者的增加而增大；玉米黃漿水添加量從25%到50%，初始pH從6到7時，ARA產量隨二者的增加而減少，在玉米黃漿水添加量為25%，初始pH為6時，ARA產量達到最大。

在玉米黃漿水添加量為25%時，葡萄糖濃度（X1）和初始pH（X3）對ARA產量的影響的響應面見圖6。

圖6 葡萄糖濃度和初始pH對ARA產量影響的響應面Fig.6 Response surface of glucose concentrations and initial pH on ARA production

由圖6可知，當葡萄糖濃度從80g/L到90g/L，初始pH從5到6時，ARA產量隨二者的增加而增加；葡萄糖濃度從90g/L到100g/L，初始pH從6到7時，ARA產量隨二者的增加而減少，要使ARA產量達到最大，葡萄糖濃度為90g/L，初始pH為6。

通過該組圖對任何兩因素交互影響ARA產量的效應進行分析與評價，并從中確定最佳因素水平。從圖4～圖6可以看出，較高的ARA產量集中在中心區(qū)域，最高濃度可以達到3.11g/L。各因素對ARA產量的影響從大到小依次為葡萄糖濃度、初始pH、玉米黃漿水添加量。等高線的形狀反映出交互效應的強弱大小，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形與之相反[10]。由圖4～圖6所知，玉米黃漿水添加量和葡萄糖濃度交互作用不顯著，玉米黃漿水添加量和初始pH交互作用顯著，葡萄糖濃度和初始pH交互作用顯著。

利用軟件Design Expert 7.1對培養(yǎng)條件工藝進行優(yōu)化，ARA產量為指標，葡萄糖濃度為94.78g/L，玉米黃漿水添加量為19.32%，初始pH為5.97時，ARA產量可達3.12g/L。根據(jù)實際情況，考慮到生產成本，在理論值的基礎上，本文做了大量的驗證試驗，最后得出葡萄糖濃度為90g/L，玉米黃漿水添加量為25%，初始pH為6時ARA產量可達3.11g/L，與理論預測值比較誤差為0.3%。表明Central－composite模型優(yōu)化可成功用于深黃被孢霉發(fā)酵生產ARA發(fā)酵條件的優(yōu)化，所得參數(shù)準確可靠，具有一定的使用價值。

3 結論

通過本實驗的研究，確定了深黃被孢霉發(fā)酵生產花生四烯酸的培養(yǎng)基的最佳條件為：葡萄糖濃度為90g/L，玉米黃漿水添加量為25%，初始pH為6，在此條件下ARA的實際產量達到3.11g/L。

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