生精障礙動物模型的研究進展

范紅艷，王艷春，顧饒勝，沈 楠，任 曠* (吉林醫(yī)藥學院:.基礎醫(yī)學院藥理教研室;.實驗中心機能實驗室，吉林 吉林 303)

近年來隨著工業(yè)化的發(fā)展、人們的生活方式的改變及生存環(huán)境不斷惡化，男性精子質量急劇下降，不育癥發(fā)病率日益增多，研究者試圖找到合適的治療男性不育的方法。男性不育癥是臨床上較為常見的性醫(yī)學疾病之一，導致本病發(fā)生的原因較為復雜，如陽痿、早泄、精液異常(包括精子數量減少或無精子、活動率低下、畸形率增高及精液液化不良癥等)及不射精癥，其中精液異常所致者約占70% ～80%，故關于男性不育癥研究的動物模型主要以精液質量異常性為主。本文將近年來的生精障礙動物模型研究進展作一綜述，為男性不育研究和治療藥物開發(fā)研究提供一定的參考?，F將各種造模方法介紹如下。

1 物理方法

1.1 熱效應致生精障礙模型

哺乳類動物的睪丸對熱十分敏感，故大多數雄性動物進化的結果是睪丸生長在腹腔外或腹腔淺表。睪丸組織局部溫度低于體溫，是精子生成的基本保證，哺乳動物陰囊溫度低于正常體溫2～3℃時，將影響精子的生成。故可利用熱效應破壞睪丸與機體溫差使睪丸溫度升高造成精子生成障礙模型，熱效應所致的睪丸功能的損傷程度取決于熱暴露時間的長短［1］。

熱效應手段一般包括溫水浴、紅外線、激光和超聲波等，其中最簡單的溫水浴造模方法為:將大鼠陰囊浸沒于43℃溫水中15 min單次即可得到少精子癥生精障礙大鼠模型［2］。各類生精細胞對熱效應的敏感程度依次為粗線期初級精母細胞＞精子細胞＞細線前期初級精母細胞;A型精原細胞及支持細胞所受影響較小。大鼠生精障礙的損傷在熱作用50 d后開始恢復。將猴子陰囊浸沒于43℃溫水每天30 min，連續(xù)兩天，即可得到少弱精子癥生精障礙猴子模型，睪丸局部熱處理通過誘導生殖細胞凋亡使精子數量減少、活性降低［3］。

激光造模方法為:以連續(xù)輸出的釹:釔鋁石榴石(Nd:YAG)激光(輸出功率為 7～10 W，波長為1.06 μm)對大鼠睪丸進行一次性照射，維持局部溫度在(43±0.5)℃，持續(xù)15 min，對精子發(fā)生迅速產生抗生精效應，對間質細胞功能只產生暫時影響。

1.2 電離輻射致生精障礙模型

電離輻射的射線具有把能量傳遞給其所通過組織的特性，輻射的能量可使組織發(fā)生電離作用，包括水和生物大分子如DNA、蛋白質等。睪丸的生殖細胞對輻射敏感，可以引起生精上皮損傷，誘導細胞凋亡，導致精子數量明顯減少［4］。有研究發(fā)現［5］，對小鼠骨盆局部照射(5 Gy)，即可損傷小鼠的生精能力。生精細胞對輻射的敏感性依次為:精原干細胞＞分化的精原細胞＞精母細胞＞精子細胞＞精子。分次照射方式所產生的破壞作用要比單次照射嚴重，損傷的表現與輻射劑量依賴性、細胞種類和細胞周期有關。電離輻射誘導生精細胞凋亡具有明顯的細胞種類規(guī)律性，在較低劑量照射(0.025 Gy)時，以精原細胞凋亡為主，隨劑量增加(0.05～0.2 Gy)才逐漸累及精母細胞，并且精原細胞凋亡率明顯高于精母細胞，很少累及精子細胞和精子。小鼠睪丸具有較強的修復輻射損傷的能力，一般可部分或完全恢復生精能力［6］。輻射致暫時性生精功能損傷后的恢復時間隨動物種屬和精原干細胞的存活數量而異。一般情況下，小鼠恢復生育的時間為50 d。

2 化學方法

2.1 環(huán)磷酰胺致少精子癥模型

環(huán)磷酰胺通過干擾DNA合成而阻礙生精細胞的有絲分裂，誘導睪丸生精細胞如精原細胞和精母細胞大量凋亡［7］，一般用于小鼠的少精子癥造模，方法有各種劑量長期喂飼、一次超大劑量腹腔注射和連續(xù)大劑量腹腔注射等，其中較好的方法是連續(xù)大劑量腹腔注射環(huán)磷酰胺。馮波等人的實驗［8］表明，給予小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺60 mg/kg，連續(xù)5 d，生精細胞和間質細胞可在末次給藥后45 d內處于顯著低水平。此法的優(yōu)點是周期短、便于造模，但是其作用時間短，小鼠生精上皮再生速度快，造模后可供研究時間短，穩(wěn)定性不超過末次給藥后25 d，不適于連續(xù)性研究，可供選擇的檢測指標有限，使用劑量和作用時間尚有不確定性。在造模中會引起10% ～25%的動物死亡也是此法的重要缺點。

2.2 白消安致無精子癥模型

白消安具有特異性地損傷小鼠生精干細胞和精原細胞的作用，從而破壞精子的產生，直接損害生精上皮，減少精子密度，減弱精子活性［9］。腹腔內單次注射白消安(40 mg/kg)后小鼠體重減輕，睪丸明顯變小萎縮，曲細精管失去正常的生精上皮結構，基底膜未見明顯的精原細胞，用藥后4周，睪丸曲細精管呈支持細胞樣表現，3個月有20%的曲細精管恢復生精。故可見，此種小鼠無精子癥模型也是可逆的。

2.3 白消安和環(huán)磷酰胺聯合致無精子癥模型

由于各種單一化學藥物造模方法均存在各種不同的缺陷(主要是動物生精能力的恢復時間)，有研究采用［10］白消安和環(huán)磷酰胺聯合的方法，即給予小鼠一次性腹腔注射白消安10 mg/kg和環(huán)磷酰胺120 mg/kg，注射后第4周睪丸曲細精管內精子、精子細胞及精母細胞消失，僅可見少量初級精母細胞和精原細胞;12周時曲細精管內僅見基底層少許精原細胞，間質組織發(fā)生纖維化;20周時曲細精管仍保持無生精功能的狀態(tài)，無明顯恢復跡象，表明此種小鼠無精子癥模型穩(wěn)定可靠。

2.4 醋酸鉛致無精子癥模型

鉛對精子發(fā)育和成熟有干擾和阻礙作用，并對精子有直接毒性。大量實驗研究表明利用醋酸鉛染毒可建立穩(wěn)定的生精障礙動物模型［11］。給予小鼠灌胃醋酸鉛20 mg/kg(連續(xù)染毒5 d)以上時，精子計數、直線運動精子數、活精子率隨染毒劑量增加而下降，而靜止不動精子數、精子畸形率和初級精母細胞染色體畸變率隨劑量增加而升高，可見醋酸鉛染毒大于20 mg/kg時可損害小鼠的生精功能。

2.5 雌激素致少/無精子癥模型

雌激素導致雄性動物生精功能障礙是經典的造模方法。給予雄性SD大鼠炔雌醚(0.33 mg/kg)單獨或與左炔諾孕酮(0.67 mg/kg)合用7 d，21 d后發(fā)現炔雌醚可干擾生殖細胞分化，導致精子生成減少、生育能力低下［12］。有研究［13］顯示，青春期前己烯雌酚較大劑量［1.0 ～10.0 μg/(kg·d)×14 d］暴露對大鼠睪丸發(fā)育及功能有明顯的近期(青春期晚期、性成熟后)和較遠期 (成年期)毒性作用，該毒性作用隨己烯雌酚的暴露劑量增加而加重，并隨鼠齡增長而逐漸減退。大劑量雌激素可明顯抑制血清睪酮分泌和精子生成，有研究［10］給予小鼠苯甲酸雌二醇4 mg/kg，連續(xù)注射15 d，注射后第4周，曲細精管內精子、精子細胞以及部分精母細胞破壞脫落消失，基底層可見部分精母細胞和精原細胞，造成生精功能的損害;注射后12周，曲細精管內可見精母細胞增多，20周時部分曲細精管內可以找到精子細胞和精子，表明部分小鼠睪丸生精功能恢復，提示此法難以構建穩(wěn)定的少/無精子癥動物模型。

2.6 甲醛致少精子癥模型

液態(tài)甲醛和氣體甲醛均具有小鼠生殖細胞毒性。氣態(tài)甲醛能誘導早期精細胞微核率增加，均呈現一定的劑量－反應關系。有研究［14］表明甲醛吸入方法給藥(10 ppm/1 h)35 d能引起大鼠精子密度、精子活動率和精子數減少。甲醛(10 mg/kg、30 mg/kg)小鼠腹腔注射，連續(xù)5 d，35 d后可見甲醛能引起精子數量減少，小鼠精子運動能力降低以及小鼠精子畸形率增高。提示甲醛能透過血睪屏障，干擾精子的生長、發(fā)育和能量代謝過程，對雄性生殖細胞具有潛在的誘變危害。

2.7 乙醇致少精子癥模型

乙醇是一種確認致畸物，母親孕期大量飲酒可致胎兒酒精綜合征，男性酗酒可使性功能減退并引起后代發(fā)育和行為異常。研究表明長期給予大鼠灌胃乙醇(7.5 g/kg，連續(xù) 13 w)，表現為精子計數減少，精子活動率下降，精子畸形率明顯升高，精子形態(tài)為某些生精細胞核固縮、變性，精子細胞變態(tài)期核固縮，曲細精管腔中脫落細胞增多，血清睪酮水平明顯降低，由此可見乙醇會抑制精子生成和睪酮合成。

3 免疫方法

3.1 實驗性抗精子抗體模型

采用人工免疫方法，將成年雄性Wistar大鼠斷頭處死，取雙側附睪，調精子數為3×109/mL，加入等量福氏完全佐劑混勻作為抗原，給實驗組大鼠雙側腹股溝皮下多點注射鼠精子抗原作為首次免疫，10 d后于上述相同部位進行加強免疫，即可造成AsAb陽性模型［15］，可見大鼠精子凋亡率顯著增加。

3.2 實驗性睪丸纖維化模型

采用制造自身免疫性睪丸炎的方法，單側睪丸內注射卡介苗，可建立大鼠睪丸纖維化模型［16］。結果肉眼可見纖維化睪丸較正常大鼠睪丸明顯縮小，并出現生精細胞層數減少，生精細胞排列紊亂，生精上皮空泡化，生精細胞脫落、壞死等形態(tài)學改變。

4 手術方法

實驗性隱睪模型:20日齡健康雄性SD大鼠1%戊巴比妥鈉麻醉，開腹，切斷一側睪丸引帶，將該側睪丸固定于后腹側壁層，制成單側隱睪大鼠模型［17］，手術后7～14 d大鼠睪丸重量減少，生殖細胞的凋亡率明顯增加［18］?；蚶?0～35日齡小鼠制作實驗性隱睪模型，即將小鼠緊靠腹股溝管處結扎一側陰囊，或縫合陰囊口，術后14 d和21 d后觀察到部分生殖細胞排列紊亂，曲細精管則組織結構異常，曲細精管逐漸萎縮，管腔繼續(xù)增大，生精上皮僅由精原細胞和一層初級精母細胞構成，隱睪側睪丸生精小管直徑逐漸變小，生精細胞數明顯減少，初級精母細胞分界不清，未見精子細胞。

5 轉基因/基因敲除方法

轉基因技術為將人工分離和修飾過的基因導入到生物體基因組中，由于導入基因的表達可引起生物體性狀可遺傳的修飾。轉基因動物的基因組中含有外源基因，但由于受遺傳鑲嵌性和雜合性的影響其有性生殖后代變異較大，難以形成穩(wěn)定遺傳的轉基因品系，部分動物會發(fā)生精子生成障礙，成為無精子癥或少精子癥的不育動物，目前國內已經有此方面的報告［19］。

基因敲除技術是新的外源性DNA導入技術，它是基因打靶技術的一種，類似于基因的同源重組，即外源DNA與受體細胞基因組中序列相同或相近的基因發(fā)生同源重組，從而代替受體細胞基因組中的相同/相似的基因序列，整合入受體細胞的基因組中。此法可產生或糾正精確的基因突變。利用基因敲除方法可以獲得無精子癥或少精子癥的雄性不育動物，研究［20］顯示，Brek基因敲除的小鼠表現為無精子不育，其圓形精子階段前發(fā)育正常，但不能變形發(fā)育為長形精子。故轉基因/基因敲除動物的穩(wěn)定性和普及還有待繼續(xù)研究。

6 展望

目前建立的生精障礙動物模型均存在一定的不足，如化學方法在對生精功能損傷的同時，對機體其他系統(tǒng)的功能也會造成損傷、模型的穩(wěn)定性欠佳等，因此研究者也不斷在改良生精障礙動物模型上積極探索。本文對于生精障礙動物模型的總結，希望對男性生殖方面的藥理研究提供一定的幫助。

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