胡桃醌誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究進(jìn)展

那文婷，李博雅，韓景春，吳亞猛，楊 森，李 洪，陳飛兒綜述，張 巍*審閱 (吉林醫(yī)藥學(xué)院:.臨床醫(yī)學(xué)院，.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 吉林 303)

胡桃醌(juglone，nuein)是存在于胡桃科胡桃屬植物胡桃楸和核桃中的小分子萘醌，又名5-羥基-1，4-奈醌;5-羥基-1，4-奈二酮。胡桃醌天然存在于胡桃屬植物和胡桃皮中，人工提取出來常為橙黃色或紅黃色針狀結(jié)晶，性質(zhì)不穩(wěn)定，溫度、pH以及光照都可以使其降解。其熔點(diǎn)為155℃，微溶于熱水，易溶于氯仿和苯，溶于乙醇和乙醚。是胡桃楸中主要的毒性物質(zhì)。

1 胡桃醌誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究背景

細(xì)胞凋亡的概念是由澳大利亞科學(xué)家John.F.H.Kerr等人于1972年首次提出的。細(xì)胞凋亡是指細(xì)胞接受某種信號或受到某些因素刺激后，為了維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定而發(fā)生的一種自主有序的死亡過程。它不是病理?xiàng)l件下的自體損傷現(xiàn)象，而是一個主動的過程，其中涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等作用過程，其目的是為更好的適應(yīng)而主動爭取的一種死亡過程。細(xì)胞凋亡通路受阻是導(dǎo)致癌細(xì)胞產(chǎn)生抗藥性的主要原因，細(xì)胞凋亡可能通過不同的途徑被啟動，因此誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是大多數(shù)抗腫瘤治療的主要機(jī)制［1-2］。

在中國民間，胡桃楸皮作為抗癌驗(yàn)方歷史悠久。胡桃醌的抗癌活性研究在國內(nèi)外均有報(bào)道，但目前關(guān)于胡桃醌誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的細(xì)胞信號調(diào)控機(jī)制尚不明確，已有報(bào)道的結(jié)論不甚一致。在胡桃醌對人肝癌BEL-7402細(xì)胞增殖和膜流動性的影響研究中［3］，一定濃度的胡桃醌作用于BEL-7402細(xì)胞4 h后線粒體膜電勢降低，提示細(xì)胞已經(jīng)開始凋亡級聯(lián)反應(yīng)。胡桃醌有效抑制了BEL-7402細(xì)胞增殖，發(fā)揮作用的機(jī)制可能是通過加快細(xì)胞膜流動性，促進(jìn)胡桃醌進(jìn)入細(xì)胞本身，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。曹軍等學(xué)者研究［4］，胡桃醌有抑制細(xì)胞體外生長作用并能阻滯胰腺癌細(xì)胞周期誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在對人結(jié)腸癌HCT-15、小鼠腹水型肝癌和自發(fā)型胃癌的研究中均已證明胡桃醌有明顯的抗癌活性［5］。胡桃醌能有效抑制人源腫瘤細(xì)胞增殖，且細(xì)胞株類型不同，敏感性不同［6］。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)［7］，胡桃醌可以封閉人外周血淋巴細(xì)胞的鉀離子通道，而鉀離子通道保持活性被認(rèn)為是細(xì)胞生長和T細(xì)胞增殖的先決條件，因此他們認(rèn)為胡桃醌的這一作用即使不是唯一的，也是胡桃醌誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要方式。此外，對胡桃醌的研究發(fā)現(xiàn)，胡桃醌對腫瘤細(xì)胞DNA合成有明顯的抑制作用，其主要抑制細(xì)胞生長的S期。通過電子顯微鏡觀察胡桃醌可以影響細(xì)胞線粒體，低濃度可使線粒體嵴減少，高濃度可使細(xì)胞質(zhì)中的線粒體空泡化，使腫瘤細(xì)胞因能量供給缺乏而受到增殖限制［8-10］，從而達(dá)到抑瘤作用。

2 胡桃醌對部分凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響與調(diào)控

2.1 對Pin1表達(dá)的抑制

肽酰-脯氨酰順反異構(gòu)酶(peptidy1-prolylcis/trans isomerase，Pin1)作為一種在磷酸化蛋白水平特異調(diào)節(jié)的變構(gòu)酶，在多數(shù)腫瘤細(xì)胞中，包括最常見的宮頸癌、前列腺癌、腦瘤、肺癌、乳腺癌及黑色素瘤均呈過度表達(dá)［11］，而過度表達(dá)是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的一個重要標(biāo)志。分子生物學(xué)研究表明，其過度表達(dá)與其他癌信號傳導(dǎo)途徑的基因和蛋白密切相關(guān)。Pin1可通過多個信號傳導(dǎo)途徑，上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)。作為重要的細(xì)胞增殖與分化的調(diào)控蛋白，Pin1整合了多個癌信號傳導(dǎo)途徑，并接受各途徑傳來的致癌信息并放大，它在致癌信號傳導(dǎo)通路中發(fā)揮著不可缺少的翻譯和放大作用。因此，通過多條途徑促進(jìn)細(xì)胞的異常增殖和腫瘤的發(fā)生，阻止Pin1的功能或減少其表達(dá)將能有效地抑制這些致癌途徑。天然產(chǎn)物胡桃醌是通過高通量篩選發(fā)現(xiàn)的第一個Pin1小分子抑制劑［12］。胡桃醌是Pin1的不可逆抑制劑，Pin1催化域中Cys113游離的SH-與胡桃醌發(fā)生Michael加成，導(dǎo)致結(jié)合腔部分打開，從而抑制了Pin1的活性［13］。此外，李玲等學(xué)者研究［14］顯示，胡桃醌可以通過抑制Pin1表達(dá)從而抑制食管癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡發(fā)生，并將食管癌細(xì)胞周期阻滯于G2/M期。Pin1小分子抑制劑的研究還處于起步階段，特異性小分子抑制劑不僅是分子生物學(xué)研究的重要工具，也是研制新型抗癌藥物的新途徑。這些結(jié)果可能為抗腫瘤治療提供了又一新的途徑，因而胡桃醌有望成為繼傳統(tǒng)化療藥物之后的又一新型化療藥物。

2.2 對Bcl-2/Bax蛋白的表達(dá)的影響

Bcl-2家族蛋白是細(xì)胞生存和死亡信號至關(guān)重要的整合因子，存在于線粒體外膜、核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，分為抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白兩大類。其中Bcl-2蛋白是家族蛋白中的重要典型抗凋亡蛋白成員。而Bax是典型的促凋亡蛋白。目前的研究認(rèn)為，Bcl-2家族蛋白可能主要是通過調(diào)節(jié)線粒體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的通透性，改變與細(xì)胞生理功能密切相關(guān)的離子或蛋白質(zhì)因子在細(xì)胞內(nèi)的分布，從而影響細(xì)胞的生存和死亡。Bax是BCL-2家族蛋白中研究比較深入的，也是最具有代表性的可在生理?xiàng)l件下形成孔道的促凋亡蛋白。在促凋亡因素的刺激下Bcl-2/Bax的比值將決定細(xì)胞的死活。國內(nèi)學(xué)者研究表明［15-16］，隨著胡桃醌劑量的增加，Bcl-2蛋白的表達(dá)呈劑量依賴性的下降趨勢，而Bax蛋白含量呈劑量依賴性的上升趨勢，Bcl-2/Bax兩者的比例呈下降的趨勢。由此可見，胡桃醌可以通過下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，上調(diào)Bax蛋白表達(dá)來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

2.3 對p53基因表達(dá)抑制

P53是現(xiàn)在研究非常廣泛的抑癌蛋白之一。P53蛋白在細(xì)胞生長以及腫瘤調(diào)控方面起著重要作用，其分為野生型和突出型。在細(xì)胞受到DNA損傷信號后，啟動p53基因，使細(xì)胞進(jìn)入G1期生長抑制。活化的P53可以激活多種編碼蛋白基因發(fā)揮抑制腫瘤的作用［17］。Michelle等報(bào)道，胡桃醌能夠降低p53基因表達(dá)和誘導(dǎo)h2ax快速磷酸化使細(xì)胞凋亡，原因可能是胡桃醌通過快速磷酸化細(xì)胞周期的各個階段的h2ax，并且使P53蛋白水平劇烈下降，從而誘導(dǎo)細(xì)胞DNA損傷，誘發(fā)細(xì)胞凋亡［10］。

2.4 對Caspase蛋白表達(dá)的影響

細(xì)胞的凋亡是一個主動的過程，與許多基因的表達(dá)、激活和調(diào)控有關(guān)。多種蛋白酶參與凋亡信號的傳導(dǎo)。最近的研究表明，胡桃醌可以通過細(xì)胞特異性Caspase依賴的信號途徑誘導(dǎo)凋亡，Caspase酶系在此過程中有重要作用。其中caspase-3是細(xì)胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)中的“核心”蛋白酶，在凋亡信號傳導(dǎo)的許多途徑中起著非常重要的作用［18］。在胡桃醌對宮頸癌Hela細(xì)胞的細(xì)胞毒作用研究中顯示［19］，不同濃度的胡桃醌可使caspase-3的活性增強(qiáng)，且具有劑量依賴性。有學(xué)者研究［20］，利用分光光度法檢測胡桃醌對Caspase活性的影響，結(jié)果表明，caspase活性呈劑量依賴性:從時(shí)間上來看，在24 h時(shí)caspase的活性達(dá)到最高。即在24 h時(shí)細(xì)胞凋亡達(dá)到高峰，胡桃醌誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡應(yīng)該為早期凋亡。作用機(jī)理為:降解細(xì)胞結(jié)構(gòu)，促使細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，包括DNA片段化及凋亡小體的形成。而且隨著胡桃醌濃度的增加，Caspase激活力度不斷加大。激活后，隨即開始其對細(xì)胞凋亡程序的啟動，開始降解細(xì)胞，并且還對線粒體內(nèi)部的活性氧自由基和ATP造成影響，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

除上述幾種誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑外，Maruo［21］等研究證明，胡桃醌能通過抑制DNA復(fù)制聚合酶活性抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116增殖。Xu等［22］發(fā)現(xiàn)胡桃醌作用于HL-60細(xì)胞后出現(xiàn)一系列凋亡，包括:細(xì)胞內(nèi)線粒體膜蛋白的丟失，細(xì)胞色素C、Smac和凋亡誘導(dǎo)因子釋放到細(xì)胞質(zhì)中，及胡桃醌誘導(dǎo)凋亡作用可被caspase-9抑制劑阻滯，研究表明胡桃醌誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡多是通過線粒體凋亡通路。

3 結(jié)語

胡桃醌具有廣泛的藥理作用，在醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)上都具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。現(xiàn)研究已經(jīng)證明，胡桃醌具有明確的抗癌活性。但其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制并未完全清晰。如今腫瘤治療高度發(fā)達(dá)，在以放療化療為主的治療中，西藥有著很好的療效，同時(shí)也存在著巨大的副作用。中藥具有多靶點(diǎn)、多效應(yīng)、不易產(chǎn)生耐藥性、不良反應(yīng)小、安全有效等優(yōu)點(diǎn)，在某種程度上可以彌補(bǔ)西藥的不足。中藥胡桃醌作為抗腫瘤活性單體仍然存在很大的研究空間，仍然需要科研工作者更加深入的研究其機(jī)制和毒性作用。在以后的研究中，可以將胡桃醌與現(xiàn)有廣譜治療藥聯(lián)合探討其作用機(jī)制的同時(shí)也將中西藥結(jié)合，既為中藥胡桃醌的臨床應(yīng)用提供了依據(jù)，又對中西藥結(jié)合治療腫瘤的可能性提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

綜上所述，可以得到胡桃醌誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制，而本文只是對上述幾種因素在部分文獻(xiàn)中出現(xiàn)的相互關(guān)系進(jìn)行歸納，胡桃醌誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡機(jī)制在其他文獻(xiàn)中會出現(xiàn)另外的影響因素，尚未達(dá)成一致結(jié)論，所以這就需要我們進(jìn)一步的研究新的凋亡分子和凋亡信號，從而研發(fā)新型的高效低毒的抗腫瘤藥物。

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