張延華,馬國(guó)紅,王愛(ài)英,王秉利,許 鵬 (山東省淡水水產(chǎn)研究所,山東濟(jì)南250117)
膠原蛋白又稱膠原,是動(dòng)物體內(nèi)結(jié)締組織的重要組成成分,約占其體內(nèi)總蛋白質(zhì)含量的1/4[1]。膠原蛋白含有豐富的甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸及羥脯氨酸。羥脯氨酸 (Hydroxyproline,Hyp)是膠原蛋白的特征性氨基酸,通過(guò)測(cè)定羥脯氨酸的含量,然后乘以相應(yīng)的系數(shù)就可以得到膠原蛋白的含量。羥脯氨酸的測(cè)定包括比色法、氨基酸分析儀法和HPLC法、電泳法等,以比色法最為常用[2]。
提取膠原蛋白的傳統(tǒng)原料主要是陸生哺乳動(dòng)物,如豬、牛的皮和骨。由于近年來(lái)哺乳動(dòng)物疫病的爆發(fā)和人畜共患病的增加,世界各國(guó)都在積極尋找新的膠原蛋白來(lái)源,同時(shí)漁業(yè)養(yǎng)殖的大規(guī)模發(fā)展使水產(chǎn)膠原蛋白替代哺乳動(dòng)物成為可能。不少學(xué)者對(duì)魚(yú)類組織中的羥脯氨酸進(jìn)行測(cè)定,以為尋找新的膠原蛋白原料提供理論依據(jù)。張俊杰等[3]曾用比色法測(cè)定魚(yú)鱗中羥脯氨酸,胡建平[4]對(duì)魚(yú)骨中的羥脯氨酸進(jìn)行過(guò)測(cè)定,魚(yú)皮中的羥脯氨酸含量也有過(guò)報(bào)道,但魚(yú)肉中羥脯氨酸的含量卻鮮有報(bào)道。本研究選取草魚(yú)(Ctencpharyngodon idellus)、鯉魚(yú) (Cyprinus carpio)、鳙魚(yú) (Aristichthys mobilis)、羅非魚(yú) (Oreochromis mossambicus)作為研究對(duì)象,對(duì)其魚(yú)肉中的羥脯氨酸含量用比色法進(jìn)行測(cè)定,以期為魚(yú)肉的綜合開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。
草魚(yú)、鯉魚(yú)、鳙魚(yú)、羅非魚(yú)均購(gòu)自濟(jì)南市某水產(chǎn)品市場(chǎng),魚(yú)體健康無(wú)病,體重1kg左右,冰塊保存運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室,每尾魚(yú)分別取背部的肌肉。由于受生長(zhǎng)環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)條件、魚(yú)體大小等因素的影響,魚(yú)體不同部位肌肉所測(cè)得的結(jié)果會(huì)有差異。就同種魚(yú)類來(lái)說(shuō),魚(yú)體背部肌肉的營(yíng)養(yǎng)成分相對(duì)比較穩(wěn)定。為了便于取樣與比較,本研究中的采樣統(tǒng)一取背部肌肉即自魚(yú)體兩側(cè)鰓蓋骨后至尾鰭前取體背部肌肉作為樣品進(jìn)行測(cè)定。用刀將魚(yú)肉在冷凍時(shí) (0℃以下)切成小塊 (約0.5cm3,邊長(zhǎng)約為8mm),置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。其中一部分用于常?guī)營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定,一部分用于羥脯氨酸的測(cè)定。
水分含量測(cè)定采用105℃烘干失水法[5],粗蛋白含量測(cè)定采用微量凱式定氮儀法[6],粗脂肪含量測(cè)定采用索氏抽提法[7],灰分含量測(cè)定采用550℃干法灰化法[8]。
4種魚(yú)肌肉樣品的羥脯氨酸含量測(cè)定方法參照GB/T 9695.23-2008/ISO 3496:1994[9]略作修改。
1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作
按文獻(xiàn) [9]的方法分別制得濃度依次為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)工作液。再分別移取4.00ml羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液于比色管中,加入2.00ml氯胺試劑,混合后于室溫下放置 (20±1)min。加入2.00ml顯色劑于比色管中,充分混合,用塑料薄膜將比色管封口,迅速放入60℃水浴中,保溫20min。取出比色管,用流動(dòng)水冷卻比色管至少3min,在室溫下放置30min。用水作參比,于(558±2)nm處用分光光度計(jì)測(cè)定光密度值。以扣除了空白的標(biāo)準(zhǔn)工作液的光密度為縱坐標(biāo),以相應(yīng)的濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.3.2 測(cè)定步驟
將切好的試樣裝入耐熱塑料袋中,70℃以上保溫30min后,冷卻。用絞肉機(jī)將試樣均質(zhì)。稱取4g試樣 (精確至0.001g)于燒瓶中,避免試樣粘在燒瓶壁上。量取 (30±1)ml硫酸溶液,加入燒瓶中,用表面皿蓋住,于105℃干燥箱內(nèi)恒溫16h。用圓形濾紙趁熱將水解產(chǎn)物過(guò)濾至250ml容量瓶中。用10ml硫酸溶液分3次洗滌燒瓶和濾紙,合并至上述容量瓶中。用水定容,搖勻。
用移液管移取一定體積 (V)的水解產(chǎn)物至250ml容量瓶中,定容后羥脯氨酸的濃度在0.5~2μg/ml之間。移取4.00ml上述溶液于比色管中,加入2.00ml氯胺試劑,混合后于室溫下放置(20±1)min。按1.3.1所述步驟與方法,用水作參比,于 (558±2)nm處用分光光度計(jì)測(cè)定光密度值。
1.3.3 羥脯氨酸含量計(jì)算
扣除空白溶液的吸收,從所得標(biāo)準(zhǔn)曲線查得水解產(chǎn)物中羥脯氨酸的含量。試樣中羥脯氨酸的含量按下式計(jì)算:
式中:X為試樣中羥脯氨酸的含量,%;c為由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的試樣溶液中羥脯氨酸的濃度,μg/ml;m為試樣質(zhì)量,g;V為從250ml容量瓶中吸取濾液的體積,ml。
4種魚(yú)肌肉基本營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可以看出,4種魚(yú)肌肉中都含有大量的水分,其中鳙魚(yú)、羅非魚(yú)都在80g/100g以上;草魚(yú)、鯉魚(yú)、鳙魚(yú)、羅非魚(yú)4種魚(yú)肌肉中干物質(zhì) 分 別 占 21.23%、25.68%、18.58% 和19.13%,這些干物質(zhì)中大部分為蛋白質(zhì),其蛋白質(zhì)含量分別占4種魚(yú)肌肉干物質(zhì)總量的76.22%、66.48%、83.66%和85.43%,其大小順序?yàn)榱_非魚(yú)>鳙魚(yú)>草魚(yú)>鯉魚(yú)。因此,僅從蛋白質(zhì)含量來(lái)說(shuō),魚(yú)肉是一種優(yōu)良的蛋白質(zhì)來(lái)源。4種魚(yú)肉中鯉魚(yú)的脂肪含量最高,草魚(yú)次之,鳙魚(yú)、羅非魚(yú)最低。4種魚(yú)灰分含量相差不大。
表1 4種魚(yú)肌肉基本營(yíng)養(yǎng)成分(鮮樣) g/100g
以羥脯氨酸濃度 (μg/ml)為橫坐標(biāo),光密度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 (圖1),計(jì)算得其回歸方程為:y=0.1692x+0.0018,相關(guān)系數(shù)R2=0.9856,可見(jiàn),光密度和羥脯氨酸濃度之間有很好的相關(guān)性。
4種魚(yú)肌肉樣品的羥脯氨酸含量測(cè)定與計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表2。
圖1 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線
表2 4種魚(yú)肉中羥脯氨酸含量
由表2可知,草魚(yú)、鯉魚(yú)、鳙魚(yú)、羅非魚(yú)魚(yú)肉中羥脯氨酸平均含量分別為0.0781、0.0743、0.0725、0.0724g/100g。
本試驗(yàn)結(jié)果表明,草魚(yú)、鯉魚(yú)、鳙魚(yú)、羅非魚(yú)的魚(yú)肉中羥脯氨酸分別為0.0781、0.0743、0.0725、0.0724g/100g,含量相差不大。這與文獻(xiàn)報(bào)道的魚(yú)皮中羥脯氨酸含量羅非魚(yú)皮 (1.86%)、金槍魚(yú)皮(2.04%)[10]相比,淡水魚(yú)肉中的羥脯氨酸含量均較低。
[1]張其清,王彭延,朱明華,等.膠原材料的生物學(xué)評(píng)價(jià) [J].生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志,1989,6(3):216-218.
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[3]張俊杰,曾慶孝.魚(yú)鱗中羥脯氨酸的測(cè)定 [J].淮海工學(xué)院學(xué)報(bào) (自然科學(xué)版),2004,13(1):53-55.
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[5]GB 5009.3-2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測(cè)定 [S].
[6]GB/T 6432-94飼料中粗蛋白測(cè)定方法 [S].
[7]GB/T 6438-92飼料粗灰分的測(cè)定 [S].
[8]GB/T 5009.6-2003食品中脂肪的測(cè)定 [S].
[9]GB/T 9695.23-2008/ISO 3496:1994肉與肉制品羥脯氨酸含量測(cè)定 [S].
[10]楊樹(shù)奇,曾少葵,周春霞,等.3種魚(yú)皮的基本成分及氨基酸組成分析 [J].廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào),2010,30(1):97-100.