新型生物全降解藥物釋放支架對(duì)小型實(shí)驗(yàn)豬冠狀動(dòng)脈內(nèi)膜的影響

賀素媛 李虎 任珊 鄭曉新 馮高科 易欣 李曉艷 蔣學(xué)俊

近年來，隨著人們生活水平的提高和改善，心血管疾病的發(fā)病率也越來越高，并且越來越年輕化，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)已逐漸成為影響人們生活質(zhì)量的一大難題。自從1987 年Sigwart等［1］成功實(shí)施了第一例冠狀動(dòng)脈支架術(shù)后，支架置入術(shù)漸漸成為臨床上治療冠心病的主要手段之一。支架置入術(shù)的發(fā)展先后經(jīng)歷了裸金屬支架置入術(shù)及藥物洗脫支架(DES)置入術(shù)等階段。目前支架內(nèi)再狹窄(in-stent restenosis，ISR)仍是困擾心血管工作者的難題，雖然抗增殖藥物應(yīng)用于支架技術(shù)使支架內(nèi)再狹窄的發(fā)生率由經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)血管成形術(shù)(PTCA)時(shí)代的30% ～45% 下降到DES 時(shí)代的10%以下［2-3］。然而，由于抗增殖藥物在抑制內(nèi)膜增生的同時(shí)亦引起支架置入部位血管內(nèi)皮化過程延遲，導(dǎo)致內(nèi)皮化不全，由此引起晚期支架血栓發(fā)生率升高至0.7%，因此仍應(yīng)受到重視［4］。此外，由于現(xiàn)有DES 為金屬支架，其本體無可降解特性，因此，其長(zhǎng)期安全性及有效性受到挑戰(zhàn)。生物可降解支架的研發(fā)為冠心病介入治療提供了新的策略，其支架本體由可降解或可吸收材料構(gòu)成，置入冠狀動(dòng)脈血管后經(jīng)過一段時(shí)間最終實(shí)現(xiàn)體內(nèi)降解，可起到短期內(nèi)支撐血管、防止血管再狹窄的作用，同時(shí)避免金屬支架永久留存所帶來的并發(fā)癥。盡管生物全降解支架前景光明，但其目前仍處于研發(fā)階段。本實(shí)驗(yàn)旨在探討新型生物全降解藥物釋放支架置入冠狀動(dòng)脈后對(duì)于置入部位血管內(nèi)膜的影響。

資料與方法

一、資料與試劑

1. 支架:本研究對(duì)照組所采用的普通聚左旋乳酸(PLLA)支架與實(shí)驗(yàn)組采用的新型生物全降解支架均由美國(guó)的Vasotech，Inc. 公司自主研發(fā)提供，支架規(guī)格為:3.0 mm×13.0 mm，對(duì)照組以PLLA 作為本體材料并融入抗增殖藥物紫杉醇構(gòu)成，實(shí)驗(yàn)組以PLLA 與無定型磷酸鈣(amorphous calcium phosphate，ACP)構(gòu)建納米顆粒做為本體材料(PLLA/ACP)，同樣將抗增殖藥物紫杉醇融入支架材料本體中構(gòu)成。見圖1。

圖1 新型生物全降解藥物支架

2. 動(dòng)物:健康小型實(shí)驗(yàn)豬10 只，雌雄各半，體重(30 ±5)kg。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組(5 只)及實(shí)驗(yàn)組(5 只)，術(shù)前常規(guī)喂養(yǎng)，于術(shù)前5 天給予口服氯吡格雷75 mg/d 及阿司匹林100 mg/d。動(dòng)物喂養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)過程遵照武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。

3. 主要試劑:C 反應(yīng)蛋白(CRP)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒購自美國(guó)RB 生物公司。核因子-κB(NFκB)抗體免疫組化試劑盒及α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SM-actin)單克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

二、方法

1. 支架置入術(shù):實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)前禁食12 h，以氯胺酮10 mg/kg、東莨菪堿0.3 mg 及咪達(dá)唑侖注射液2 mg 耳后肌內(nèi)注射進(jìn)行誘導(dǎo)麻醉。術(shù)中以0.9%氯化鈉注射液200 ml +丙泊酚注射液200 mg +氯胺酮注射液200 mg 靜脈滴注維持麻醉。直視下逐層分離右側(cè)股動(dòng)脈，置入6 F 動(dòng)脈鞘同時(shí)給予肝素6000 U。分別行正中位、左前位及右前位冠狀動(dòng)脈造影后，隨機(jī)選取左前降支、左回旋支或右冠狀動(dòng)脈置入PLLA 支架或PLLA/ACP 支架，以10 ～14 atm(1 atm=101.325 kPa)撐開支架，持續(xù)20 ～30 s 后釋放，退出球囊后再次行冠狀動(dòng)脈造影，未見血管夾層及血栓。支架置入術(shù)后逐層縫合切口，并給予食飼氯吡格雷75 mg/d、阿司匹林325 mg/d 至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，術(shù)后每日給予青霉素200 萬U 肌注預(yù)防感染，連續(xù)3 d。

2. 血液學(xué)檢測(cè):分別在術(shù)前和術(shù)后28 d 取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物股動(dòng)脈血，采用免疫吸附法檢測(cè)血清中的CRP濃度。

3. 病理形態(tài)學(xué)檢查

(1)蘇木精-伊紅(HE)染色:術(shù)后4 周復(fù)查冠狀動(dòng)脈造影后處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，迅速取出心臟以0.9%肝素生理鹽水高壓灌注至灌流液清亮，再以10%甲醛溶液高灌注至心臟組織完全固定。分離支架置入部位血管并以石蠟包埋切片，行HE 染色，鏡下觀察置入部位血管有無血栓形成。每張切片取五個(gè)視野，在400 倍顯微鏡下計(jì)數(shù)淋巴細(xì)胞個(gè)數(shù)，并以炎癥積分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估其炎癥情況:0 分=無內(nèi)膜炎癥;1 分=散在炎性細(xì)胞;2 分=25% ～50%血管周徑內(nèi)支架被炎癥細(xì)胞包繞50%，3 分=25% ～50%血管周徑內(nèi)支架被炎癥細(xì)胞全部包繞［5］。并使用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)(Image Pro Plus 6.0)測(cè)定計(jì)算以下指標(biāo):HE 染色切片(×40)新生內(nèi)膜面積(外彈力板圍繞面積－殘余管腔面積)、管腔面積及面積狹窄百分比(新生內(nèi)膜面積/外彈力板圍繞面積×100%)。

(2)免疫組化檢測(cè):冠狀動(dòng)脈標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋后用SP 法(具體方法依據(jù)試劑盒說明進(jìn)行)檢測(cè)NF-κB、α-SM-actin 抗體，并用微波進(jìn)行抗體修復(fù)。NF-κB 抗體:使用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)測(cè)定，用圖像分析儀于高倍鏡(×400)下在每張切片取五個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞及平均陽性細(xì)胞百分率，取其平均值。α-SM-actin 抗體:使用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)測(cè)定計(jì)算免疫組織化學(xué)α-SM-actin 染色切片(×200)平均光密度值。

4. 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用 珋x ±s 表示，兩組間及組內(nèi)自身前后差異比較采用t 檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1. 一般情況:所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均正常存活至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行冠狀動(dòng)脈支架置入術(shù)后對(duì)動(dòng)物覓食、活動(dòng)等一般情況無影響。

2. 造影結(jié)果:支架置入術(shù)后即刻及術(shù)后4 周行冠狀動(dòng)脈造影復(fù)查，均可見支架置入血管管腔通暢，TIMI 血流達(dá)3 級(jí)，無急性及慢性支架血栓形成，且無明顯管腔狹窄。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組無差別。見圖2。

3. 血液學(xué)檢測(cè)結(jié)果:免疫吸附法檢測(cè)CRP 濃度顯示，術(shù)前與術(shù)后血液中CRP 濃度比較，對(duì)照組［(688.56 ± 128.91)ng/ml 比(757.19 ± 104.46)ng/ml，P ＞0.05］和實(shí)驗(yàn)組［(704.12 ± 142.46)ng/ml比(773.27 ±110.18)ng/ml，P ＞0.05］差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩組術(shù)后CRP 比較亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［(757.19 ± 104.46)ng/ml 比(773.27 ± 110.18)ng/ml，P ＞0.05］。

4. HE 染色:(1)炎癥反應(yīng):支架置入術(shù)后4 周，置入部位血管HE 染色切片40 倍顯微鏡下觀察可見:置入部位管腔通暢，未見支架血栓形成，且血管管腔結(jié)構(gòu)正常完整，支架小梁完整，小梁上內(nèi)皮覆蓋完整。病理切片可見:與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組淋巴細(xì)胞數(shù)(27.32 ± 1.50 比54.12 ± 3.99，t = 14.06，P ＜0.05)及炎癥積分(1.04 ±0.17 比2.08 ±0.23，t =8.13，P ＜0.05)明顯降低，即實(shí)驗(yàn)組炎癥反應(yīng)明顯降低。見圖3。(2)內(nèi)膜增生:實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組支架新生內(nèi)膜面積［(2.10 ±0.75)mm2比(2.07 ±0.28)mm2，P ＞0.05］及 面 積 狹 窄 百 分 比［(54.78 ±14.21)%比(53.52±13.85)%，P ＞0.05］差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即實(shí)驗(yàn)組支架未引起置入部位血管內(nèi)膜顯著增生。見圖4。

5. 免疫組織化學(xué)檢查結(jié)果:(1)NF-κB 免疫組化染色:以免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)NF-κB 陽性細(xì)胞數(shù)，陽性細(xì)胞主要分布在血管內(nèi)皮及內(nèi)膜的細(xì)胞核內(nèi)，呈棕黃色顆粒。實(shí)驗(yàn)組陽性細(xì)胞百分比表達(dá)明顯降低(25.28% ± 0.68% 比44.02 ± 0.95%，t =32.12，P ＜0.05)。(2)α-SM-actin 免疫組織化學(xué)染色:以免疫組織化學(xué)技術(shù)特異性檢測(cè)α-SM-actin 陽性光密度值，評(píng)估支架置入部位血管平滑肌細(xì)胞增殖情況。兩組α-SM-actin 免疫組織化學(xué)染色平均光密度值相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1.71% ±0.87%比1.71 ±0.86%，P ＞0.05)。兩組中α-SM-actin 染色陽性細(xì)胞多位于血管中膜，血管內(nèi)膜少見，說明兩組均無平滑肌細(xì)胞明顯內(nèi)遷，且實(shí)驗(yàn)組支架未引起置入部位平滑肌細(xì)胞明顯增生。見圖5。

圖2 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組支架置入后即刻及28 d 后造影結(jié)果

圖3 術(shù)后兩組置入部位血管HE 染色結(jié)果

圖4 術(shù)后兩組置入部位血管HE 染色

圖5 兩組術(shù)后4 周置入部位α-SM-actin 免疫組織化學(xué)染色

討 論

在冠心病的治療歷程中，DES 的應(yīng)用是冠心病介入治療的里程碑之一，其通過攜帶抗增殖藥物，抑制局部平滑肌增殖、遷移及分泌細(xì)胞外基質(zhì)，減少血管內(nèi)膜過度增生，從而使支架內(nèi)再狹窄率顯著降低［6］。然而，隨著臨床的應(yīng)用和研究的進(jìn)展，DES的弊端也不斷暴露，比如其釋放模式并不理想，涂層的抗增殖藥物在抑制平滑肌增殖的同時(shí)也抑制了內(nèi)皮的修復(fù)，從而增加了術(shù)后血栓的發(fā)生率。藥物洗脫后殘留的涂層和金屬支架本體也容易引起局部炎癥反應(yīng)，延遲內(nèi)皮愈合，從長(zhǎng)遠(yuǎn)來看并沒有降低冠心病心肌梗死的再發(fā)率和死亡率［7］。

以聚合物為代表的各種生物全降解支架的出現(xiàn)，有望解決此問題。PLLA 生物材料因其良好的可吸收性及組織相容性，被美國(guó)食品藥品管理局(FDA)列為可應(yīng)用于人體的生物工程材料，成為目前最為常用的生物可降解支架的構(gòu)建材料。PLLA在自然狀態(tài)下降解速度較慢，完全降解需要2 年左右，且其在生物體內(nèi)降解的最終產(chǎn)物為對(duì)機(jī)體無明顯毒性的二氧化碳和水［8］，因此，PLLA 本身的降解特性即決定了其可以在完成支架早期支撐血管、避免血管急性閉塞及防止再狹窄的作用后，在一定的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)生物體內(nèi)逐步無害化完全降解，從而避免了支架本身作為一種異物長(zhǎng)期存在于病變血管內(nèi)刺激血管平滑肌細(xì)胞增殖，或是支架長(zhǎng)期存留觸發(fā)持續(xù)的炎癥反應(yīng)進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)膜過度增生及再狹窄形成［9］。

然而，PLLA 構(gòu)建生物可降解支架應(yīng)用于臨床醫(yī)療決策仍存在亟待解決問題。如其在降解過程中可誘發(fā)置入部位血管明顯的炎癥反應(yīng)［10］。Vogt等［11］觀察到，PLLA 生物可降解支架在降解過程中，支架周圍有慢性炎癥細(xì)胞聚集，且通常伴有炎癥反應(yīng)及細(xì)胞增殖速度加快。而炎癥反應(yīng)在血管成形術(shù)或支架置入術(shù)后再狹窄的發(fā)生中起關(guān)鍵作用。Kornowski 等［12］觀察接受冠狀動(dòng)脈支架置入術(shù)的豬證實(shí)，炎癥反應(yīng)與內(nèi)膜增生顯著相關(guān)，而炎癥反應(yīng)亦與冠狀動(dòng)脈支架置入術(shù)后粥樣斑塊撕裂及血管壁損傷相關(guān)。因此，減輕PLLA 降解中產(chǎn)物所誘發(fā)的炎癥反應(yīng)程度，逐步成為目前生物降解材料研發(fā)的重點(diǎn)之一。

本研究所采用的新型生物全降解支架是由PLLA 與ACP 通過納米顆粒技術(shù)制成并將抗增殖藥物紫杉醇融入支架本體而構(gòu)成的新型生物材料。

紫杉醇是1988 年美國(guó)FDA 正式批準(zhǔn)用于臨床的新型抗腫瘤藥物，通過作用于細(xì)的微管功能抑制G1/G0和G1/M 期的細(xì)胞復(fù)制來抑制細(xì)胞的增生［13-15］，將紫杉醇融入支架本體中可實(shí)現(xiàn)藥物緩慢釋放及高度可控，可能獲得既抑制平滑肌細(xì)胞增殖，又不會(huì)對(duì)內(nèi)膜產(chǎn)生明顯損害的作用，有望解除原有DES 對(duì)血管內(nèi)皮和平滑肌雙重抑制的弊端［16-17］。

ACP 是采用濕化學(xué)法合成羥基磷灰石時(shí)出現(xiàn)的磷酸鈣的一種無定形中間相，它短暫存在于合成羥基磷灰石的過程中，在水溶液中不穩(wěn)定［18］。有文獻(xiàn)報(bào)道，在生物可降解材料中加入ACP 可中和生物材料降解過程中產(chǎn)生的酸性產(chǎn)物，進(jìn)而可減少由酸性產(chǎn)物所引起的無菌性炎癥反應(yīng)［19］。此外，ACP 尚有利于藥物的傳遞釋放及增加支架的機(jī)械性能［20-22］，使紫杉醇可以更好地抑制平滑肌的增殖以減少局部的炎癥反應(yīng)和冠狀動(dòng)脈的再狹窄。ACP的這些優(yōu)點(diǎn)為本實(shí)驗(yàn)研究提供了豐富的理論基礎(chǔ)。

1. 炎癥反應(yīng):炎癥反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵的作用，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病其實(shí)是一種炎癥性疾病，同時(shí)炎癥反應(yīng)又是促進(jìn)冠狀動(dòng)脈支架置入術(shù)后新生內(nèi)膜增生和再狹窄的原因之一［22］。因此，減輕或消除炎癥反應(yīng)是減少支架置入術(shù)后再狹窄的關(guān)鍵。CRP 是機(jī)體高度靈敏的炎癥指標(biāo)，是在機(jī)體受到嚴(yán)重炎癥損傷時(shí)由白介素(IL)-6 調(diào)控，肝合成入血的急性相關(guān)蛋白，CRP的升高與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)術(shù)后4 周血液中CRP 濃度比較結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組術(shù)前、術(shù)后28 d CRP 濃度比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩組28 d 后相比，CRP 濃度差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明支架置入后都沒有引起明顯的炎癥反應(yīng)。NF-κB 作為一種能調(diào)控多種基因的具有多種效應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，已被證實(shí)當(dāng)局部炎癥反應(yīng)較明顯時(shí)，其表達(dá)也會(huì)增強(qiáng)。此外，NF-κB 參與動(dòng)脈粥樣硬化、血管成形術(shù)后再狹窄和其他血管增殖性病變等病理生理過程。因此，支架置入部位NF-κB 的表達(dá)反應(yīng)是評(píng)價(jià)其局部炎癥情況的重要指標(biāo)。免疫組化檢測(cè)顯示，實(shí)驗(yàn)組NF-κB 表達(dá)數(shù)明顯少于對(duì)照組，且HE 染色顯示，實(shí)驗(yàn)組支架置入部位炎性細(xì)胞明顯少于對(duì)照組?？梢妼?shí)驗(yàn)組術(shù)后在一定程度上減輕了局部的炎癥反應(yīng)，優(yōu)于對(duì)照組，具有良好的組織相容性。

2. 內(nèi)膜增生:基于既往的研究報(bào)道，減輕炎癥反應(yīng)可有一定的抑制內(nèi)膜增生的作用，因此，據(jù)此推測(cè)，加入ACP 的新型全降解支架可能通過抑制炎癥反應(yīng)而抑制內(nèi)膜增生。此外，Kim 等［23］報(bào)道ACP 在與細(xì)胞接觸時(shí)具有更好的細(xì)胞黏附性，同時(shí)可減少細(xì)胞凋亡并促進(jìn)細(xì)胞增殖及遷移，因此，ACP 材料的加入除可減輕PLLA 支架降解過程中誘發(fā)的炎癥反應(yīng)外，還具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖及支架置入部位血管內(nèi)皮化，減少支架晚期血栓發(fā)生的可能。然而，加入ACP 的PLLA 支架在促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的同時(shí)，是否同樣促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞過度增殖而導(dǎo)致內(nèi)膜過度增生，進(jìn)而升高再狹窄發(fā)生率，目前尚無明確報(bào)道。

既往研究表明，α-SM-actin 血管平滑肌細(xì)胞來源的標(biāo)志，其表達(dá)增多通常提示血管平滑肌細(xì)胞增殖，同時(shí)亦提示平滑肌細(xì)胞增殖及遷移可能。本研究表明，加入ACP 的PLLA 支架與普通PLLA 支架相比，α-SM-actin 的平均光密度值無明顯增高，該結(jié)果證實(shí)，加入ACP 材料并不會(huì)促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖，且觀察發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組α-SM-actin 陽性細(xì)胞表達(dá)多位于血管中膜部位，而內(nèi)膜及新生內(nèi)膜部位表達(dá)不明顯，說明實(shí)驗(yàn)組支架未引起明顯平滑肌細(xì)胞遷移。同時(shí)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在血管內(nèi)膜增生厚度方面，雖實(shí)驗(yàn)組置入部位的血管內(nèi)膜稍有增生，但兩組相比差異同樣無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，該結(jié)果也證實(shí)加入ACP 材料亦無導(dǎo)致內(nèi)膜明顯增生的可能。因此，基于本研究結(jié)果，加入ACP 的PLLA 支架雖不能明顯減輕，但亦不會(huì)導(dǎo)致置入部位血管內(nèi)膜增生及平滑肌細(xì)胞增殖及遷移。該結(jié)論可能與支架材料構(gòu)建過程中PLLA 與ACP 的合成配比有關(guān)，ACP 材料本身雖能在一定程度上減輕由PLLA 降解所引起的無菌性炎癥反應(yīng)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖及內(nèi)皮化過程，但同樣可能在一定程度上促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖及內(nèi)膜增生，因而兩種效應(yīng)疊加最終并未對(duì)置入部位血管內(nèi)膜增生產(chǎn)生明顯不良影響。

綜上所述，初步證實(shí)采用特殊納米技術(shù)加入ACP 的新型生物全降解藥物釋放支架具有良好的組織相容性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，其可以明顯減輕置入部位無菌性炎癥反應(yīng)，且不會(huì)導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞明顯增生及遷移。該新型生物全降解藥物釋放支架的研發(fā)為冠心病介入治療策略提供了新思路。

但本研究動(dòng)物樣本量較少，觀察時(shí)間點(diǎn)較為單一，觀察時(shí)間較短(28 d)，且尚未從細(xì)胞及分子水平研究加入ACP 的新型生物可降解支架影響血管內(nèi)膜增生及平滑肌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制。然而基于本研究的初步結(jié)果，樣本量更大、術(shù)后觀察時(shí)間更長(zhǎng)、涉及內(nèi)膜增生及平滑肌細(xì)胞增殖的分子生物學(xué)機(jī)制的研究已經(jīng)進(jìn)行。另外，針對(duì)支架材料構(gòu)建過程中，ACP 和PLLA 的合成配比、其與血管內(nèi)膜增生及平滑肌細(xì)胞增殖的相關(guān)性研究，也將是未來研究的重點(diǎn)之一。

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