糞腸球菌的群體感應(yīng)現(xiàn)象

塔 娜，賀銀鳳

( 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018)

乳酸菌是目前世界上公認(rèn)安全的食品級微生物，且是一種廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)生產(chǎn)的革蘭氏陽性細(xì)菌。細(xì)菌素是乳酸菌在代謝過程中產(chǎn)生的一類蛋白類抗菌物質(zhì)，可在體內(nèi)被蛋白酶消化［1］，并對與其遺傳關(guān)系相近的細(xì)菌具有溶菌或殺菌作用［2］。群體感應(yīng)(quorum sensing，QS)，是細(xì)菌根據(jù)種群密度大小進(jìn)行胞內(nèi)或胞間信息傳遞，調(diào)節(jié)群體行為和調(diào)控基因表達(dá)的一種機(jī)制［3］。它利用可在細(xì)胞間擴(kuò)散的信號分子來感知菌群的數(shù)量變化，在信號分子的濃度到達(dá)一定數(shù)值時(shí)將啟動其相關(guān)的基因表達(dá)，調(diào)控與之相關(guān)生物學(xué)功能［4］，是乳酸菌與外界環(huán)境進(jìn)行信息交流的重要調(diào)控系統(tǒng)，特別是與細(xì)菌素合成有關(guān)的QS 機(jī)制，因此對它的研究有助于構(gòu)建食品級基因表達(dá)系統(tǒng)并解釋發(fā)酵調(diào)控機(jī)理。QS 機(jī)制最先在費(fèi)氏弧菌(Vibrio fischeri)中被發(fā)現(xiàn)，其主要組分為LuxI-LuxR 蛋白，并用信號分子N-?；呓z氨酸內(nèi)酯(acyl-homoserine lactones，AHLs)進(jìn)行傳遞［5］。而在革蘭氏陽性菌(G +)中，細(xì)胞與細(xì)胞間的信號傳導(dǎo)是通過分泌修飾后的小分子寡肽類物質(zhì)(Autoinducing peptides，AIP)完成的［6］。與具有種特異性的AHLs 和AIP 這兩類信號分子不同，二型自誘導(dǎo)物(autoinducer 2，AI-2)是種間細(xì)胞交流的通用信號分子。本實(shí)驗(yàn)研究對象是采樣于內(nèi)蒙古錫林郭勒盟地區(qū)牧民家庭自制酸馬奶酒中的各株乳酸菌。賀銀鳳等已對樣品進(jìn)行了乳酸菌的分離和抗菌活性的探究，對其中篩選出的抑菌活性最強(qiáng)的兩株菌:腸膜明串珠菌葡聚糖亞種3-3-2 和糞腸球菌4-3-2，研究了其影響抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)生的因素，抑菌譜，細(xì)菌素的粗提及粗提物理化特性，并探討了這兩株菌最佳培養(yǎng)基配比、提取與純化具有抑菌活性的物質(zhì)及其在巴氏乳中防腐保藏方面的運(yùn)用，且從乳酸菌與酵母菌共生關(guān)系上對發(fā)酵產(chǎn)品的發(fā)酵機(jī)理做了進(jìn)一步的闡述。但是在實(shí)驗(yàn)過程中時(shí)有抑菌性消失的現(xiàn)象，因此設(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

糞腸球菌4-3-2(enterococcus faecalis):本課題實(shí)驗(yàn)用菌，分離于酸馬奶酒，用于群體感應(yīng)現(xiàn)象研究，酸馬奶酒課題組提供;枯草芽孢桿菌(bacillus subtilis):用于牛津杯法的指示菌，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供;MRS 培養(yǎng)基［7］用于枯草芽孢桿菌活化的培養(yǎng)液，準(zhǔn)確稱取蛋白胨1g、牛肉膏1g、酵母提取物0.5g、磷酸氫二鉀0.2g、無水乙酸鈉0.5g、檸檬酸銨0.2g、碳酸鈣0.025g、鹽液A 0.5mL，吐溫-80 0.1g、將其溶在100mL 蒸餾水中，將pH 調(diào)至7～7.2，在121℃，15min 滅菌備用;TPY 培養(yǎng)基［7］用于糞腸球菌的培養(yǎng)，準(zhǔn)確稱取胰蛋白胨0.8g、大豆蛋白胨0.8g、酵母提取物0.5g、NaCl 0.5g、磷酸二氫鉀0.3g、六水合氯化鎂0.05g、半胱氨酸鹽酸鹽0.05g、七水合硫酸亞鐵0.001g、吐溫-80 0.1g、葡萄糖3g，將其溶在100mL 蒸餾水中，將pH 調(diào)至6.5，在121℃，15min 滅菌備用。

表1 實(shí)驗(yàn)的9 種不同培養(yǎng)條件Table 1 Nine different kinds of culture conditions in experiment

LXJ1IB 型離心機(jī) 上海領(lǐng)成生物科技有限公司;Uvmini-1240 紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司;TOLEDO FE20 酸度計(jì) 德國賽多利斯;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海島通應(yīng)用科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的制備 按2%的接種量將4-3-2 接入無菌TPY 培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，連續(xù)活化3d。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 抑菌活性的檢測 用牛津杯法［8］測定抑菌活性。

1.2.3 對菌體生長及細(xì)菌素H 的變化過程研究 按2%接種量將菌株4-3-2 接入到TPY 培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48h，每隔4h 取樣測定菌體濕重、OD600nm值、發(fā)酵上清液的抑菌活性。每隔6h 取樣用平板計(jì)數(shù)法測定菌落總數(shù)。將發(fā)酵液3000r/min 離心20min 后除去菌體，留取上清液，即為含有細(xì)菌素H 的粗制液。以發(fā)酵時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌體濕重和H 抑菌直徑為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)菌素H 動態(tài)變化過程曲線。再以發(fā)酵時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600nm值和細(xì)菌總數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制菌體生長曲線。

1.2.4 確定細(xì)菌素生成的最低菌群密度實(shí)驗(yàn) 通過改變培養(yǎng)溫度的高低和培養(yǎng)基營養(yǎng)的富寡，設(shè)置九種培養(yǎng)條件來改變細(xì)胞密度。按表1 中所述的條件培養(yǎng)48h，每隔6h 分別取樣測定在不同培養(yǎng)條件的不同時(shí)間段內(nèi)的菌體濕重及菌株的抑菌活性。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出不產(chǎn)生細(xì)菌素的條件，以此為細(xì)菌素H 產(chǎn)生的低密度培養(yǎng)條件，即閾值。

1.2.5 不同濃度的信號分子對菌株抑菌活性的影響按2%接種量將菌株4-3-2 接入到TPY 培養(yǎng)基中，因?yàn)槠湓诓煌臅r(shí)間有不同的菌體密度，信號分子濃度亦會隨菌體密度的改變而改變，所以在培養(yǎng)到6、12、24、36h 時(shí)將發(fā)酵液3000r/min 離心20min后獲得上清液，視為含有不同濃度信號分子的溶液。信號分子可能是蛋白質(zhì)或肽類物質(zhì)，這在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中會得到驗(yàn)證。在低密度(即閾值)條件下培養(yǎng)4-3-2 至對數(shù)生長期(8h)，分別在發(fā)酵液中加入以上不同濃度信號分子溶液(×10 濃縮)，繼續(xù)培養(yǎng)24h，研究細(xì)菌素積累量的變化。以未發(fā)酵的培養(yǎng)基作為對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌體生長及產(chǎn)細(xì)菌素H 動態(tài)變化過程

如圖1 所示，發(fā)酵的前8h，菌體開始進(jìn)入對數(shù)生長期，細(xì)菌素H 的抑菌性隨著菌體的生長開始顯現(xiàn)，8h 之后，菌體生長進(jìn)入對數(shù)生長期中后期，由于菌體4-3-2 的快速生長，細(xì)菌素H 的抑菌活性也以對數(shù)趨勢增長，發(fā)酵約12h 后進(jìn)入穩(wěn)定期，在12～20h 內(nèi)抑菌活性變化不大，于是以8～20h 做為4-3-2 產(chǎn)生細(xì)菌素H 的高峰期。

圖1 菌株4-3-2 菌體濕重及H 產(chǎn)量變化曲線Fig.1 Wet weight and H yield curve of Enterococcus faecalis 4-3-2

如圖2，菌株在4h 內(nèi)生長極為緩慢，4h 后OD600nm值幾乎是直線上升，菌株進(jìn)入對數(shù)生期，12～20h 內(nèi)改變不大，24h 后略有下降。每隔6h 測定菌株的菌落總數(shù)，取其值的對數(shù)作圖。經(jīng)過48h 培養(yǎng)，菌株4-3-2 的菌落總數(shù)可達(dá)到108CFU/mL。

圖2 菌株4-3-2 生長曲線Fig.2 Growth curve of Enterococcus faecalis 4-3-2

2.2 不同條件下菌株4-3-2 的細(xì)胞密度與抑菌活性的關(guān)系

依照1.2.4 設(shè)計(jì)的生長條件，菌株4-3-2 的生長情況和抑菌活性不同。從圖3 可以看出，溫度的變化對其菌體密度有影響，但培養(yǎng)基的富寡是影響其生長的主要因素。用TPY 培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，發(fā)酵液的OD600nm值最高可以達(dá)到2.1496，1/2TPY 次之，最大可達(dá)到1.8924，1/5TPY 最低，最大也僅能達(dá)到1.1796。從圖4 可知，利用牛津杯法檢測這9 種條件下的抑菌活性，得出在32、37 、42℃的1/5 TPY 培養(yǎng)條件下，穩(wěn)定期的細(xì)胞密度為OD600nm= 1.1680、1.1896、1.1714，均小于1.2，此時(shí)無抑菌活性。因此抑菌活性的產(chǎn)生是依賴于細(xì)胞密度的，由此可得出閾值密度培養(yǎng)條件(即細(xì)菌的細(xì)胞密度低于此值就不表達(dá)抑菌活性)為:1/5TPY 培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h。

表2 添加信號分子對H 抑菌活性的影響Table 2 Effect of adding autoinducer on the antibacterial activity of H

圖3 不同培養(yǎng)條件下4-3-2 細(xì)胞密度Fig.3 The density of 4-3-2 cells in different culture conditions

圖4 不同培養(yǎng)條件下H 抑菌活性Fig.4 Antibacterial activity of H under different culture conditions

同一培養(yǎng)基在32、37、42℃培養(yǎng)溫度下，抑菌活性在37℃時(shí)最好(抑菌直徑為15.23mm，TPY 培養(yǎng)基，37℃)，溫度過高或過低都不利于抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生。同一培養(yǎng)溫度在TPY，1/2TPY，1/5TPY 條件下，抑菌圈直徑和細(xì)胞密度OD600nm在TPY 時(shí)最大，1/2TPY次之，1/5TPY 最低，而且菌株代謝產(chǎn)物的抑菌活性是隨著細(xì)胞密度的升高而增大的。因此，二者的變化趨勢在一定范圍內(nèi)成正比，且菌株4-3-2產(chǎn)生的細(xì)菌素H 抑菌活性的代謝是依賴于細(xì)胞密度的。

2.3 細(xì)菌素H 的濃度對抑菌活性的影響

將含有不同濃度信號分子的溶液加到閾值培養(yǎng)條件下的菌株發(fā)酵液進(jìn)行培養(yǎng)，由表2 可以看出，組1 和組2 與對照樣(即菌株在TPY 和1/5TPY 條件下培養(yǎng))相比，菌株菌體濕重和抑菌活性的變化不大，由此可忽略培養(yǎng)基對抑菌活性的影響;添加105CFU/mL對4-3-2 的抑菌活性幾乎沒有影響，添加106、107CFU/mL 的發(fā)酵液其抑菌活性有提高，抑菌圈直徑分別由原來的11.31、15.49mm 提高到14.67、16.51mm，說明信號分子對菌株抑菌活性有影響，不同濃度的信號分子確實(shí)可以提高菌體產(chǎn)細(xì)菌素的能力。當(dāng)添加108CFU/mL 濃度的上清液時(shí)，卻由11.02mm 下降到10.68mm。這有兩個(gè)假設(shè):一是在生長到某些時(shí)期抑菌活性的下降，推測是因?yàn)榧?xì)菌素會附著在其菌體細(xì)胞表面;二是細(xì)菌素H 的抑菌活性僅僅在一定范圍內(nèi)與菌體密度成正比，過高則抑菌活性會下降［9］。

3 結(jié)論

本文通過對不同培養(yǎng)條件的控制，初步認(rèn)為細(xì)菌素H 抑菌活性受到糞腸球菌4-3-2 發(fā)酵液的菌體密度影響。當(dāng)發(fā)酵液菌體密度低于閾值時(shí)，不表現(xiàn)抑菌活性;當(dāng)加入不同濃度發(fā)酵上清液時(shí)，細(xì)菌素H抑菌性與之成正相關(guān)。但是，這種正相關(guān)只在一定菌體密度范圍內(nèi)適用，當(dāng)菌體密度超過這個(gè)值時(shí)，其抑菌活性沒有隨之增加，反而會有所降低。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)細(xì)菌素H 的糞腸球菌發(fā)酵液中含有信號分子，且證明了信號分子為細(xì)菌素H，其自身濃度是影響細(xì)菌素產(chǎn)量和抑菌性的關(guān)鍵因素。依據(jù)此實(shí)驗(yàn)可知，添加不同濃度的信號分子，發(fā)酵液中細(xì)菌素H 的產(chǎn)量和抑菌活性會發(fā)生改變。同時(shí)，細(xì)菌素H 的抑菌活性受發(fā)酵液中菌體的群體感應(yīng)系統(tǒng)影響，并且其本身可進(jìn)行自我誘導(dǎo)。

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