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      固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜及氣相色譜-嗅聞技術(shù)分析美味牛肝菌風(fēng)味活性物質(zhì)

      2013-08-07 09:13:46齊玉剛張春霞劉安軍王麗霞宋曉娣
      食品工業(yè)科技 2013年10期
      關(guān)鍵詞:牛肝菌吡嗪美味

      曹 蓓,齊玉剛,張春霞,劉安軍,王麗霞,鄭 捷,白 云,宋曉娣

      (天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,天津300457)

      美味牛肝菌(Boletus edulis)俗稱大腳菇,屬層菌綱,傘菌目,牛肝菌科,牛肝菌屬,子實(shí)體粘軟多汁,香滑可口,富含蛋白質(zhì)維生素多糖類物質(zhì)氨基酸和多種礦物元素,其提取物具有增強(qiáng)免疫力抗癌抗輻射等功能[1]。除營養(yǎng)和藥用外,可食用牛肝菌的的風(fēng)味也引人關(guān)注,其所特有的風(fēng)味異于芳香植物和其他菌類食品。近年來,隨著生活水平的提高和消費(fèi)觀念的轉(zhuǎn)變,人們在追求攝入食品營養(yǎng)的同時(shí),對食品風(fēng)味的追求日益增加。對于美味牛肝菌風(fēng)味成分的研究,對于闡明其呈味機(jī)理并且為開發(fā)新一代調(diào)味品奠定理論基礎(chǔ),具有深遠(yuǎn)的現(xiàn)實(shí)意義。目前,有關(guān)牛肝菌營養(yǎng)成分的研究較多[2-5],而對于其揮發(fā)性成分研究較少。頂空固相微萃?。℉S-SPME)方法是把取樣、萃取、富集、進(jìn)樣等過程在同一個(gè)裝置完成。與其他分離方法相比,此方法選擇性好,不需要溶劑,所需樣品用量少,且操作簡單、快速、費(fèi)用低,并可與氣相色譜或液相色譜直接聯(lián)用[6]。氣相色譜-嗅覺測量法(GC-O)是近年來發(fā)展起來的鑒定食品風(fēng)味活性物質(zhì)的技術(shù)手段,這種方法彌補(bǔ)了氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)不能檢測到一些閾值很低的痕量風(fēng)味物質(zhì)的缺陷。本實(shí)驗(yàn)以美味牛肝菌為原料,通過HS-SPME技術(shù)萃取樣品中的揮發(fā)性成分,并將GCMS與GC-O方法結(jié)合起來,對樣品中的揮發(fā)性成分進(jìn)行定性、定量及風(fēng)味活性成分分析,為牛肝菌調(diào)味品的開發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

      1 材料與方法

      1.1 材料與儀器

      美味牛肝菌干品 購于昆明農(nóng)貿(mào)市場,將樣品粉碎,過40目篩;C6~C20正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品 德國Sigma公司。

      4000MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國瓦里安Varian 技術(shù)有限公司;Sniffer 系列嗅覺計(jì) 瑞士Brechbuhler公司;手動固相微萃取進(jìn)樣器、65μm PDMS/DVB萃取頭、15mL頂空進(jìn)樣瓶 美國Supelco公司;高速中藥粉碎機(jī) 武義縣屹立工具有限公司;電子分析天平 上海精天電子儀器有限公司;HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋 天津玻璃儀器廠。

      1.2 實(shí)驗(yàn)方法

      1.2.1 HS-SPME處理 稱取樣品粉末2.0g置于15mL頂空樣品瓶中,用聚四氟乙烯襯里的硅橡膠墊密封,置于45℃水浴鍋中平衡30min后,將經(jīng)過老化處理的固相微萃取頭通過瓶蓋的橡皮墊插入到樣品瓶中大約1cm處,推出纖維頭。于45℃水浴中萃取30min后,將萃取頭迅速插入GC-MS聯(lián)用儀的進(jìn)樣口,于250℃下解析15min,同時(shí)啟動儀器采集數(shù)據(jù)。

      1.2.2 GC-MS分析條件 色譜條件:色譜柱型號為VF-5ms(30m×0.25mm×0.25μm),載氣為高純度氦氣(99.999%),流速為1mL/min,進(jìn)樣口溫度為250℃,進(jìn)樣時(shí)以分流方式進(jìn)樣。采用兩段式程序升溫:起始溫度為40℃,保持3min,然后以4.0℃min升溫至150℃,并保持1min,再以8℃/min升溫至250℃,保持6min。

      質(zhì)譜條件:電離源為EI,離子阱溫度為220℃,GC-MS傳輸線溫度為280℃,EI電子能量為70eV,溶劑延遲時(shí)間1.5min。掃描方式為全掃描(fμμ),范圍為43~500m/z。

      1.2.3 定性分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理由Xaclbiur軟件系統(tǒng)完成,未知化合物經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索同時(shí)與NSIT05譜庫(107k compounds)相匹配,僅當(dāng)正反匹配度均大于800(最大值為1000)的鑒定結(jié)果才予以報(bào)道。采用相同的升溫程序,以C6~C20的正構(gòu)烷烴作為標(biāo)準(zhǔn),以其保留時(shí)間計(jì)算樣品測試中的化合物的保留指數(shù),再通過查閱相關(guān)文獻(xiàn),與文獻(xiàn)中的化合物的保留指數(shù)(RI)相比較,與質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果共同定性。

      化合物保留指數(shù)RI計(jì)算公式:

      式中,RI樣品—樣品色譜峰的RI;RI前—樣品色譜峰前面烷烴標(biāo)樣的RI;Rt樣品—樣品色譜峰的Rt;Rt前—前面烷烴標(biāo)樣的Rt;Rt后—后面烷烴標(biāo)樣的Rt;Rt—色譜峰的保留時(shí)間。

      1.2.4 定量分析 通過Xaclbiur工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),按峰面積歸一化法進(jìn)行定量分析,從而得出各化學(xué)成分在美味牛肝菌物質(zhì)中的相對百分含量。

      1.2.5 GC-O分析 樣品前處理同樣采用HS-SPME方法,同1.2.1;色譜條件和質(zhì)譜條件同1.2.2;色譜柱與嗅聞口的分流比設(shè)置為1∶1。本實(shí)驗(yàn)選擇5名有經(jīng)驗(yàn)的感官評價(jià)員進(jìn)行嗅覺分析,記錄風(fēng)味特征和強(qiáng)度。在實(shí)驗(yàn)過程中至少有3名感官評價(jià)員在同一嗅聞時(shí)間處能得到相同的感官描述,則將該記錄記入最終結(jié)果,氣味的強(qiáng)度以星號個(gè)數(shù)做記號。沒有嗅聞到氣味不計(jì)星號,“*”表示該化合物氣味微弱,“**”表示該化合物氣味中等,“***”表示該化合物氣味強(qiáng)烈。統(tǒng)計(jì)5位感官評價(jià)員對記入最終結(jié)果的每種化合物所進(jìn)行的星號標(biāo)記,最后計(jì)算每種氣味成分所得星號的平均值(四舍五入取整),作為該化合物氣味強(qiáng)度的最終結(jié)果。實(shí)驗(yàn)過程中感官評價(jià)員輪流分析,以避免嗅覺疲勞。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 美味牛肝菌的揮發(fā)性成分鑒定

      美味牛肝菌揮發(fā)性成分的總離子流色譜圖見圖1。從圖1可見,在此分析條件下得到的圖譜分離度和定量準(zhǔn)確度均較好。通過NSIT05譜庫進(jìn)行匹配度和圖譜比較,初步確定樣品中揮發(fā)性成分。同時(shí),根據(jù)Kovats計(jì)算式,得到各未知物的RI實(shí)驗(yàn)測得值。然后在NSIT05譜庫數(shù)據(jù)庫以及相關(guān)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(www.webbook.nist.gov)、(www.odour.org.uk)和相關(guān)文獻(xiàn)資料中檢索各未知物的RI值,進(jìn)行比較,進(jìn)一步確認(rèn)樣品中的揮發(fā)性成分,見表1。其中,C6~C20正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間與對應(yīng)RI值的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。

      圖1 美味牛肝菌揮發(fā)性成分GC-MS總離子流色譜圖Fig.1 GC-MS total ion chromatogram of volatile components of Boletus edulis

      圖2 C6~C20正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品的保留指數(shù)-保留時(shí)間圖Fig.2 Retention index(RI)and retention time(RT)relations of C6~C20 hydrocarbon standard compounds

      由表1中可知,從美味牛肝菌中分離鑒定得到53種揮發(fā)性化合物,主要由吡嗪類、烴類、醇類、酮類、醛類、酸類、酯類、含硫類、呋喃等化合物組成。其中含量最高的吡嗪類化合物有12 種,占總成分的58.87%;其次酸類化合物有4種,占總成分的5.15%;醛類化合物有5種,占總成分的4.73%;烴類化合物有

      9種,占總成分的3.57%;酯類化合物有2種,占總成分的3.36%;醇類化合物有6種,占總成分的2.95%;酮類化合物有6種,占總物質(zhì)的2.49%;同時(shí),一些雜環(huán)及其他化合物含量也很高,如2-噻吩甲醛(10.50%)、2-正戊己呋喃(2.296%)、2-乙酰基吡咯(1.963%)等。在這53種揮發(fā)性成分中,相對含量較高的有2,6-二甲基吡嗪、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪、2-噻吩甲醛、2-乙基-3-甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、丙位戊內(nèi)酯、己醛、2-戊基呋喃、甲酚、4-羥基-2-酮丁酸、1-辛烯-3-醇、2-乙?;量?、異丙烯基吡嗪、2-十一酮、甲基吡嗪、苯甲醛、己酸、2,5-二甲基-3-異戊基吡嗪和檸檬烯。

      表1 牛肝菌揮發(fā)性成分的分析及鑒定結(jié)果Table 1 Analysis and identification of volatile components of Boletus

      2.2 美味牛肝菌的特征性風(fēng)味物質(zhì)鑒定

      僅通過各揮發(fā)性物質(zhì)的相對含量不能確定美味牛肝菌的特征性揮發(fā)性化合物,還需要利用GC-O來鑒定對風(fēng)味有貢獻(xiàn)的物質(zhì),分析鑒定結(jié)果列于表2。

      如表2所示,在53種已定性的美味牛肝菌揮發(fā)性成分中,有29種可被感官評價(jià)員嗅聞到,此外還有3種未知化合物呈現(xiàn)特殊氣味,但是不能被GC-MS檢測到,這是因?yàn)檫@些化合物閾值較低,且在樣品中的含量極低,不能為質(zhì)譜所鑒定。分析結(jié)果表明,美味牛肝菌的特征性風(fēng)味主要以堅(jiān)果香、烤肉香、蘑菇味、花香、烤面包香味等風(fēng)味特征為主。這些風(fēng)味主要由吡嗪類、醛類、醇類、酮類等化合物釋放出來的。

      吡嗪類化合物是美味牛肝菌中鑒定出來的種類最多、含量最豐富的揮發(fā)性化合物,且由于其閾值較低,普遍帶有令人愉悅的堅(jiān)果、燒烤等氣味,對美味牛肝菌特征性風(fēng)味的貢獻(xiàn)很大。吡嗪類化合物是美味牛肝菌中的糖及其分解產(chǎn)物與氨基酸發(fā)生了美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物[18],樣品中檢測到大量這類化合物,可能是美味牛肝菌在干制過程中發(fā)生了美拉德反應(yīng)。Thomas[19]在干制牛肝菌中也檢測到了9種吡嗪類化合物,其中有4種與本實(shí)驗(yàn)檢測到的一致。2-戊基呋喃也是閾值很低(4×10-9g/mL)的含氮雜環(huán)化合物,具有豆香、果香、泥土、青香及類似蔬菜的香韻[20],對美味牛肝菌的香氣也有很大貢獻(xiàn)。

      醛類化合物也是美味牛肝菌香氣的重要的成分,如樣品中檢測到的己醛、苯甲醛、苯乙醛等。這些醛類化合物主要是脂質(zhì)的氧化或氨基酸的strecker降解生成的[21],一般閾值都較低,己醛的閾值為4.5×10-9g/mL[22],是中等分子質(zhì)量的醛,具有清香、酯香風(fēng)味,在樣品中提供了青草香氣。苯甲醛、苯乙醛屬于芳香醛,由苯丙氨酸降解生成[23],具有令人愉悅的杏仁香和花香。酮類化合物的生成和醛類化合物類似,具有獨(dú)特的清香和果香風(fēng)味,且閾值較低[24],對美味牛肝菌的花香、果香風(fēng)味有貢獻(xiàn)。

      醇類化合物多為脂質(zhì)氧化或羰基化合物還原生成的,通常具有芳香、植物香、酸敗和土腥味,因其自身的閾值對食品風(fēng)味的貢獻(xiàn)很小,但某些不飽和醇類卻是食品香氣的重要組成部分。1-辛烯-3-醇是八碳化合物的代表,八碳化合物對食用菌的風(fēng)味有著直接的影響,這些短鏈的八碳化合物,是由不飽和脂肪酸,尤其以亞油酸和亞麻酸為主,經(jīng)脂肪氧化酶催化轉(zhuǎn)變而成的。1-辛烯-3-醇具有濃郁的蘑菇風(fēng)味,素有“蘑菇醇”稱號,它幾乎存在于所有品種的食用菌中,在美味牛肝菌中,1-辛烯-3-醇相對含量為2.059%,且氣味強(qiáng)度很大,對其呈味有非常重要的作用。

      一般來講,飽和烴類化合物的閾值都較高,對食品的風(fēng)味貢獻(xiàn)不大。但是萜烯類化合物相對飽和烴類閾值較小,具有一定風(fēng)味。如長葉烯具有松節(jié)油香氣,檸檬烯具有橙皮清香,對美味牛肝菌的風(fēng)味呈現(xiàn)均有一定貢獻(xiàn)。

      表2 美味牛肝菌中特征性揮發(fā)性化合物的分析及鑒定結(jié)果Table 2 Analysis and identification of specific volatile components in Boletus edulis

      在美味牛肝菌特征性揮發(fā)性化合物中還有一類含硫化合物,如3-甲硫基丙醛、2-噻吩甲醛,這類化合物是含硫氨基酸降解產(chǎn)生的,呈現(xiàn)一種硫化物氣味。此外,還有一些酸類、酯類、酚類及一些未知化合物在牛肝菌香氣中起著調(diào)和互補(bǔ)的作用,共同構(gòu)成了美味牛肝菌的風(fēng)味特征。

      3 結(jié)論

      本研究使用HS-SPME方法對美味牛肝菌的揮發(fā)性成分進(jìn)行提取,再通過GC-MS對其揮發(fā)性成分進(jìn)行了分析,并結(jié)合保留指數(shù)鑒定出53種化合物,其中有12種吡嗪類化合物,占總揮發(fā)性成分的58.87%,是美味牛肝菌的主要揮發(fā)性成分。美味牛肝菌揮發(fā)性成分中含量較高的化合物有2,6-二甲基吡嗪(30.09%)、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪(13.32%)、2-噻吩甲醛(10.50%)、2-乙基-3-甲基吡嗪(5.35%)、2-乙基-6-甲基吡嗪(4.06%)、丙位戊內(nèi)酯(3.34%)、己醛(2.54%)、2-正戊基呋喃(2.30%)等。

      通過GC-O方法鑒定美味牛肝菌的特征性揮發(fā)性物質(zhì),共得到32種特征性香氣成分,其中有3種物質(zhì)不能通過GC-MS檢測到。通過對美味牛肝菌特征性揮發(fā)性化合物的氣味強(qiáng)度進(jìn)行記錄,氣味強(qiáng)度較大的主要有己醛(青草味)、甲基吡嗪(堅(jiān)果香味)、3-甲硫基丙醛(焦香)、2,6-二甲基吡嗪(烤肉香)、1-辛烯-3-醇(蘑菇味)、2-戊基呋喃(豆香)、2-乙基-6-甲基吡嗪(烤香)、3-辛烯-2-酮(蘑菇味)、苯乙醛(花香)等化合物,它們對美味牛肝菌的整體風(fēng)味貢獻(xiàn)很大,是主要的揮發(fā)性風(fēng)味活性物質(zhì)。

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