透明質(zhì)酸聯(lián)合羥乙基淀粉預防術后腹腔粘連的作用機制初探＊

大連大學生命科學與技術學院（大連116600） 董 爽 金 華 袁玉姣 蔣 革

腹腔粘連是腹部外科手術后常見的并發(fā)癥之一，常導致腹部不適或持續(xù)疼痛、粘連性腸梗阻和不孕癥等并發(fā)癥，給患者帶來極大的痛苦和經(jīng)濟損失［1］。粘連現(xiàn)象的形成主要是纖維蛋白的沉積超過纖維蛋白的溶解，在此過程中受多種生長因子和細胞因子參與調(diào)控，其中轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF－β1）和腫瘤壞死因子α（TNF－α）的影響較大［2］。本研究觀察透明質(zhì)酸（HA）與羥乙基淀粉（HES）混合制備的新型防粘連劑對術后大鼠腹腔粘連的預防作用，并利用HE染色和免疫組化的方法觀察粘連局部的TGF－β1和TNFα表達情況，并對HA－HES新型防粘連劑的防粘連機理進行探討。

對象與方法

1 實驗對象 體重200±20g的健康雄性SD大鼠20只，由大連醫(yī)科大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（遼）2008－0002。

2 主要試劑及儀器 ①主要試劑：兔抗鼠多克隆TGF－β1抗體與兔抗鼠多克隆 TNF－a抗體、SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒及HE染色試劑盒均購自武漢博士德生物技術公司。1×PBS緩沖液（pH7．2～7．4）購自上海生工生物工程有限公司。透明質(zhì)酸與羧甲基纖維素（HA－CMC）防粘連劑（Guardix－sol）購自韓國韓美藥品株式會社。②主要儀器：滑動切片機（金華市蓋迪醫(yī)療設備廠，YD202A）、烘箱（上海精宏實驗設備有限公司，DHG－9147A）、顯微鏡（NOVEL，N－800M）、冰箱（新飛 BCD－248EMC）、多功能生物顯微 鏡 （OLYMPUS BX51）、 微 波 爐 （Midea MM721NH1－PW）等。

3 實驗方法 ①腹腔內(nèi)粘連程度情況觀察及評級：健康的雄性SD大鼠20只，隨機分成4組：假性粘連組（5只）、生理鹽水對照組（5只）、HA－CMC對照組（5只）和HA－HES實驗組（5只）。麻醉后，開腹，找出盲腸部分，用干紗布反復輕輕擦拭至腸漿膜層受損面積為1．2cm×1．2cm，表現(xiàn)為表面有針尖大血點，紗布上出現(xiàn)淡紅色。在損傷部位正對面的腹腔壁用手術刀做損傷一樣大的面積。用手術線把離盲腸損傷部位1cm的兩處與腹腔壁損傷部位對稱的固定，以防止運動摩擦帶來的影響，促進粘連發(fā)生。假性粘連組不做任何處理，對生理鹽水對照組、HA－CMC對照組和HA－HES實驗組粘連部位分別注入0．9%生理鹽水、HA－CMC防粘連劑、HA－HES防粘連劑5ml，關腹。術后分籠飼養(yǎng)，均禁食10h，飼養(yǎng)飼料均為同一種大鼠飼料，手術7d后解剖觀察各實驗組的腹膜粘連情況。腹腔粘連程度分類標準：參考Phillips 5級分類法［3］。②HE染色：手術7d后解剖觀察各實驗組的腹膜粘連情況，同時將粘連組織銳性切除，包括腹膜及粘連相關組織。標本行4μm厚連續(xù)切片，進行 HE染色［4］，光鏡下觀察各組織形態(tài)學變化。③免疫組織化學檢測：TGF－β1和TNF－α免疫組織化學染色參照試劑盒說明書操作。用正常羊血清替代一抗做陰性對照，已知TGF－β1和TNF－α陽性組織切片做陽性對照。TGF－β1和TNF－α陽性結(jié)果的判定標準：整體觀察每張切片，以成纖維細胞中胞質(zhì)或胞核內(nèi)出現(xiàn)黃色顆粒為TGF－β1陽性表達細胞；以細胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆?；蚱瑺罱Y(jié)構(gòu)為TNF－α陽性表達。

4 圖像分析及定量分析 采用Image－Pro Plus 6．0圖像分析軟件，切片在光鏡下統(tǒng)一放大400倍進行測量。每張切片按等距離抽樣原則隨機攝取5個視野，輸入計算機作為測定視野。分別測定出每個視野中陽性表達面積百分比，進而計算出平均陽性表達面積百分比，作為其陽性表達值。判定標準：0級（－）：無陽性染色；Ⅰ級（＋）：陽性染色面積占0～25%；Ⅱ級（?）：陽性染色面積占25%～50%；Ⅲ級（?）：陽性染色面積占50%～75%；Ⅳ級（■）：陽性染色面積占75%以上。

5 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 17．0統(tǒng)計軟件，采用χ2檢驗及秩和檢驗處理所有數(shù)據(jù)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 腹腔粘連情況觀察 大鼠腹腔解剖實驗觀察見圖1，HA－HES實驗組大鼠的腹腔粘連程度與生理鹽水對照組和HA－CMC對照組比較，HA－HES實驗組粘連程度最輕。生理鹽水對照組粘連面積為0．80±0．16cm2，HA－CMC對照組粘連面積為0．64±0．15cm2，HA－HES實驗組粘連面積0．06±0．10cm2。HE染色實驗發(fā)現(xiàn)生理鹽水對照組明顯有血管生成，成纖維細胞增多，HA－CMC對照組血管增生不明顯，但粘連面積較大，見圖2。生理鹽水對照組均為Ⅲ級或Ⅳ級粘連；HA－CMC對照組均為Ⅱ級或Ⅲ級粘連；HA－HES實驗組均為0級或Ⅰ級粘連；HA－HES實驗組粘連分級及粘連發(fā)生率情況比生理鹽水組和HACMC對照組明顯減輕，差異顯著（P＜0．05），見表1。

表1 各組腹膜粘連等級比較結(jié)果

2 TGF－β1及TNF－α的表達 在正常腹膜組織和粘連組織中，鏡下可見TGF－β1蛋白主要表達與成纖維細胞的胞核或胞質(zhì)內(nèi)，呈棕黃色或黃色顆粒狀物質(zhì)（圖3，A、B、C、D）。粘連組織中 TGF－β1表達于術后開始逐漸升高，通過測定陽性表達值，假性粘連組陽性表達為0級占60%，Ⅰ級占20%，Ⅱ級占20%；生理鹽水對照組陽性表達為Ⅱ級占20%，Ⅲ級占40%，Ⅳ級占40%；HA－CMC對照組陽性表達為Ⅰ級占20%，Ⅱ級占60%，Ⅲ級占20%；HA－HES實驗組0級占20%，Ⅰ級占40%，Ⅱ級占40%，較生理鹽水對照組陽性表達等級0級高20%，Ⅰ級高40%，Ⅱ級高20%，較HA－CMC對照組陽性表達等級0級高20%，Ⅰ級高20%。HA－HES實驗組與生理鹽水對照組和 HACMC對照組相比較，TGF－β1表達差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05），見表2。在腹膜損傷及粘連組織中，鏡下可見TNF－α在纖維組織中的巨噬細胞的胞質(zhì)中表達，呈棕黃色的顆粒狀，細胞核被復染成藍色（圖3，E、F、G、H）。術后粘連組織中TNF－α表達逐漸升高，通過陽性表達測定，發(fā)現(xiàn)HA－HES實驗組陽性表達等級最低，生理鹽水對照組陽性表達等級最高，HA－CMC對照組居于二者之間。HA－HES實驗組陽性表達等級0級占20%，Ⅰ級占40%，Ⅱ級占40%；較HA－CMC對照組0級高20%，Ⅰ級高20%，Ⅱ級高20%；較生理鹽水對照組0級高20%，Ⅰ級高40%，，Ⅱ級高40%；HA－HES實驗組與生理鹽水對照組和HA－CMC對照組相比較，TNF－α表達差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05），見表2。

圖1 大鼠腹膜粘連的效果圖

圖2 HE染色在各個實驗組中的效果（×400）

圖3 TGF－β1和TNF－α在正常組織和粘連組織中的表達（×400）

表2 TGF－β1和TNF－α在各實驗組腹膜損傷處及粘連組織中的表達情況比較結(jié)果（n＝5）

討 論

術后腹膜粘連產(chǎn)生的過程大致分為3個階段［5］：炎癥階段：腹膜損傷后，局部出現(xiàn)炎癥反應，導致細胞釋放出組胺和細胞因子等炎癥調(diào)節(jié)物，引起富含纖維蛋白的血漿液滲出。纖維蛋白溶解階段：機體正常纖溶平衡被破壞，纖維蛋白的溶解減少，沉積增加，在損傷腹膜表面形成纖維蛋白構(gòu)成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。纖維化階段：巨噬細胞受到炎性因子的趨化，向炎癥部位運動，釋放出大量TGF－β和TNF－α等細胞因子；這些細胞因子刺激組織中的纖維母細胞轉(zhuǎn)化成成纖維細胞，數(shù)量成倍增加，膠原纖維大量沉積，纖維化程度加重。最終導致腹膜粘連的形成。

在上述腹膜粘連形成過程中，TGF－β和TNF－α在腹膜粘連形成過程中起到重要的作用［6］。大量文獻表明，TGF－β在炎癥反應、腫瘤血管形成中大量表達。2003年美國的Freeman等［7］在SD大鼠的動物實驗中證實手術刮傷漿膜引起腹膜粘連，粘連組織中TGF－β1和TGF－β3的mRNA表達分別比對照組的高3．7倍和8．6倍。此外，TGF－β有促進新生血管生成的作用。TNF－α主要由激活的巨噬細胞分泌，在人和動物的脂肪細胞、內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞亦可產(chǎn)生。TNF－α具有多種生物學活性，研究證實［8］，TNF－α能促進肺、肝、腹膜和皮膚等組織纖維化過程中成纖維細胞的增殖，促進粘連形成。

本研究顯示TGF－β1和TNF－α主要在腹膜組織的成纖維細胞中，應用免疫組化技術測定粘連組織中的表達率比正常腹膜組織中高，而且生理鹽水對照組和HA－CMC對照組的 TGF－β1和 TNF－α表達明顯高于HA－HES實驗組。同時，利用 HE染色可以觀察到HA－HES實驗組腹膜粘連程度低于生理鹽水對照組和HA－CMC對照組。說明HA與HES混合制備的新型防粘連劑對TGF－β1和TNF－α的表達有明顯的抑制作用，從而證明HA－HES防粘連劑預防術后腹膜粘連形成的一條重要機理在于抑制炎性滲出液中細胞因子的表達水平，特別是TGF－β1和TNF－α的表達水平，從而起到有效地預防粘連的作用。

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