光動力療法抑制兔耳增生性瘢痕形成的實(shí)驗(yàn)研究＊

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院皮膚科 （西安710004） 王 瓊 袁景奕 王秀瑩 董穎穎 張鼎偉

增生性瘢痕（HS）是一種頑固的皮膚病，目前常用的各種治療方法并不理想，還會產(chǎn)生不同程度的不良反應(yīng)［1，2］。光動力療法（PDT）廣泛應(yīng)用于各種腫瘤性疾病和皮膚病，并且不會產(chǎn)生顯著的不良反應(yīng)［3］?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）和金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs）對細(xì)胞、血管、組織具有復(fù)雜的調(diào)節(jié)作用。因此我們提出PDT的作用機(jī)理與調(diào)節(jié) MMPs／TIMPs的平衡有關(guān)，擬使用不同濃度的5－氨基酮戊酸（ALA）－PDT對兔耳HS模型進(jìn)行干預(yù)，觀察其對皮損外觀、組織病理的影響。同時檢測標(biāo)本中 MMP－2、3、9及TIMP－1蛋白的表達(dá)和β－半乳糖苷酶（β－gal）濃度，初步探討PDT對的HS的治療作用機(jī)制。

材料與方法

1 材料與試劑

1．1 主要儀器試劑：XD－635AB型光動力激光治療儀和ALA購自中國上海復(fù)旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司。RNA抽提試劑盒Rneasy kit購自德國Qiagen公司。熒光定量RT－PCR分析儀、SYBR green與Taq－DNA聚合酶混合試劑LightCycler均購自瑞士Roche公司。β－gal酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒購自美國santa cruz公司。

1．2 實(shí)驗(yàn)動物：選擇新西蘭大耳白兔10只，雌雄不限，質(zhì)量2．0－2．5kg，飼養(yǎng)環(huán)境22±2℃，12h晝夜循環(huán)。參照Kloeters等的方法建立兔耳HS模型［4］。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2．1 實(shí)驗(yàn)分組：將形成的HS隨機(jī)分為5組，造模后第3周進(jìn)行ALA－PDT干預(yù)：①20%ALA組局部使用ALA溶液濃度236mg／ml；②10%ALA組使用溶液濃度118mg／ml；③直接照射組（Dr）不使用ALA溶液；④無任何處理的陰性對照組（Neg）；⑤選取陰性對照組兔耳正常皮膚組織作為正常對照組（Nor）。具體方法：用配好的ALA藥液浸濕醫(yī)用藥棉，覆蓋于創(chuàng)面，封包3h后進(jìn)行激光照射，設(shè)置為光斑1．0cm，時間20min，能量密度114．6J／cm2。于瘢痕形成后每周處理1次，總共4次。于治療結(jié)束后60d觀察各組瘢痕形態(tài)。

2．2 Masson膠原染色：根據(jù)Masson’s三色染色試劑盒操作說明，組織切片用二甲苯去石蠟，梯度乙醇水化，在Weigert＇s蘇木紫工作液中染色10min，品紅溶液染色5min，置于1% 磷酸鹽溶液中浸5min后將切片移至甲苯胺藍(lán)溶液染色5min，漂洗、脫水、清潔、包埋，膠原纖維被染成藍(lán)色。

2．3 RT－PCR 測 MMP／TIMP mRNA：使 用Rneasy kit試劑盒進(jìn)行組織總RNA的抽提，用Taq－Man逆轉(zhuǎn)錄試劑進(jìn)行RT－PCR，利用熒光定量RTPCR分析儀LightCycler和SYBR green與Taq－DNA聚合酶混合試劑對 MMP－2、3、9、TIMP－1和 GAPDH的mRNA起始量進(jìn)行分析比對，從溶解曲線可以確定Ct值和樣本中最初的mRNA拷貝數(shù)。結(jié)果數(shù)據(jù)以所檢測的mRNA拷貝數(shù)／GAPDH mRNA拷貝數(shù)的相對值表示。

2．4 ELISA法測β－gal濃度：皮膚組織勻漿離心取上清，按ELISA試劑盒說明書操作，用450nm酶標(biāo)儀檢測并生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出最終結(jié)果。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件包作數(shù)據(jù)處理，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用ANOVA方差分析。

結(jié) 果

1 外觀形態(tài)變化：兔耳創(chuàng)面上皮化后局部形成高出于周圍正常組織的瘢痕，共造80個創(chuàng)面，術(shù)后3周最終形成78處HS模型，選取其中72處作為實(shí)驗(yàn)觀察對象。在PDT治療4次后，瘢痕組織開始出現(xiàn)軟化、變平，增生塊顏色逐漸變淡。治療后60d，瘢痕明顯軟化，顏色和質(zhì)地均接近正常皮膚。20%ALA組較10%ALA組為好，10%ALA組較Dr組為好。

2 Masson膠原染色：陰性對照組兔耳HS（圖1 E）與正常皮膚組織（圖1A）比較可見大量藍(lán)染較深的膠原纖維，增厚密集，外形粗大，排列雜亂無章。治療后60d的HS雖然也可見藍(lán)染的膠原纖維，但較治療前藍(lán)染變淺且纖細(xì)，膠原纖維數(shù)量減少，排列疏散并趨于一致，并且改善程度20%ALA組（圖1B）＞10%ALA組（圖1C）＞Dr組（圖1D）。20%ALA組的組織病理形態(tài)已接近正常對照。

圖1 各組膠原纖維 Masson染色（光鏡×400）A：正常對照組，B：20%ALA組，C：10%ALA組，D：Dr組，E：陰性對照組

圖2 熒光定量RT－PCR檢測 MMP／TIMP mRNA結(jié)果（與陰性對照組比較，＊P＜0．05，＊＊P＜0．01，＊＊＊P＜0．001）

圖3 ELISA法檢測β－gal濃度結(jié)果（與陰性對照組比較＊P＜0．05，＊＊P＜0．01，＊＊＊P＜0．001）

3 RT－PCR測 MMP／TIMP mRNA：RT－PCR結(jié)果顯示 MMP－2、3、9和 TIMP－1在正常皮膚組織中的mRNA表達(dá)量均較少。陰性對照組MMPs mRNA表達(dá)受抑制，低于正常，經(jīng)PDT治療后升高，20%ALA組＞10%ALA組＞Dr組。陰性對照組TIMP－1mRNA呈強(qiáng)表達(dá)，經(jīng)治療后降低，20%ALA組＜10%ALA組＜Dr組。GAPDH mRNA在各組的表達(dá)無顯著差異（圖2）。

4 ELISA法測β－gal濃度：所有PDT治療組的βgal濃度水平顯著高于陰性對照組，其中20%ALA組＞10%ALA組＞Dr組，并且20%ALA組水平接近于正常對照組（圖3）。表明PDT可促進(jìn)成纖維細(xì)胞的老化。

討 論

機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞衰老是一種重要的抗腫瘤防衛(wèi)機(jī)制，創(chuàng)傷修復(fù)過程中老化型成纖維細(xì)胞在控制其增殖和膠原合成方面起著重要的作用，是瘢痕形成的重要抑制因素［5］。我們以往在培養(yǎng)成纖維細(xì)胞過程中也發(fā)現(xiàn)復(fù)制老化的成纖維細(xì)胞I、Ⅲ型膠原合成量減少［6］。病理性瘢痕現(xiàn)有的手術(shù)切除、放療等治療方法無法誘導(dǎo)病變部位發(fā)生足夠量的細(xì)胞老化，同時還會引起細(xì)胞凋亡或壞死，死亡的細(xì)胞又會誘發(fā)新一輪的增殖修復(fù)，造成了臨床療效差且復(fù)發(fā)率高。因此，如果使成纖維細(xì)胞提前進(jìn)入衰老階段，控制其細(xì)胞增殖及膠原合成，將有可能從根本上改變各種病理性瘢痕的發(fā)展。

研究發(fā)現(xiàn)MMPs／TIMPs在HS組織及光老化皮膚中的表達(dá)明顯異于正常皮膚，MMP1、MMP2、MMP3和MMP9的聯(lián)合作用可以降解大部分真皮ECM［7～9］，而 TIMP1 主 要 抑 制 MMP1、MMP3 和MMP9［10］。我們的研究中，陰性對照組兔耳 MMPs表達(dá)最低，TIMP1表達(dá)最高，表明在兔耳的HS組織中細(xì)胞老化受到抑制，給予PDT后的各組兔耳MMPs表達(dá)明顯升高、活性增強(qiáng)，同時TIMP1表達(dá)和活性降低，表示應(yīng)用PDT可誘導(dǎo)瘢痕形成過程中的MMPs／TIMPs比例發(fā)生變化，促進(jìn)成纖維細(xì)胞老化，從而顯著降低膠原蛋白和ECM的合成、抑制HS形成。

本實(shí)驗(yàn)中對兔耳HS模型形成的早期（術(shù)后第3周）即開始進(jìn)行PDT治療，使用較高濃度ALA治療4次后效果非常滿意，目前很多應(yīng)用PDT治療瘢痕的研究也表明對此類患者早期治療的療效更佳［11］。另外，由于PDT的無創(chuàng)性，并且對新愈合的創(chuàng)面也無明顯刺激和毒副作用，因此我們建議對HS患者在發(fā)病早期進(jìn)行PDT治療，并且適當(dāng)增加光敏劑的濃度以達(dá)到更好的療效。另外PDT治療各種病理性瘢痕還具有以下優(yōu)勢：①PDT組織選擇性好、作用于光敏藥物局部、毒性低、創(chuàng)傷小，可最大程度的保護(hù)容貌及重要器官功能。②病理性瘢痕形成過程中增殖旺盛的成纖維細(xì)胞功能活躍，這些細(xì)胞較普通細(xì)胞可以攝取并儲蓄更多的光敏劑。本研究為PDT治療病理性瘢痕提供了理論支持和依據(jù)，并對病理性瘢痕的治療提供新的思路。

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