茶樹菇多糖提取的復合酶制劑篩選及工藝研究

周瑤，毛淑紅，孫祺，華伯元，王娜，胡曉杰，劉莎，路福平，*

（1.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室（天津科技大學），天津 300457；2.天津科技大學生物工程學院，天津 300457；3.工業(yè)酶國家工程實驗室，天津 300457；4.天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津科技大學，天津 300457）

食用菌是一類營養(yǎng)豐富并有很高食用和藥用價值的大型真菌總稱[1]，它作為一類高蛋白、低脂肪、營養(yǎng)價值很高的綠色食品日益受到全世界的重視，并成為保健食品的重要功能因子[2-4]，因此社會對食用菌的研究也越來越深入。食用菌富含多糖、維生素、氨基酸等天然活性成分，其中多糖是一類具有某種特殊生物活性的化合物，具有免疫調(diào)節(jié)功能[5]、抗腫瘤[6]、延緩衰老、降血糖[7]、抗血栓作用等。

茶樹菇（Agrocybe aegerita）又叫茶薪菇，楊樹菇，柱狀田頭菇，柳松茸等，屬于真菌界、擔子菌門、層菌綱、傘菌目、糞銹傘科、田蘑屬，民間曬干后用于頭暈、頭痛、嘔吐及小兒低燒、老人氣喘等癥狀的治療，因此被人們稱為“菇中珍品”，享有“中華神菇”，“神仙菇”之稱?，F(xiàn)代醫(yī)學研究證明,其可滋陰壯陽，對腎虛、尿頻、水腫、癌癥、高血壓、早衰及小兒低熱、尿床等都有較理想的輔助治療功能[8]。茶樹菇是一種富含多糖的高蛋白﹑低脂肪，礦物質(zhì)含量相對較高，營養(yǎng)價值很高的食用菌。茶樹菇多糖的提取方法主要包括熱水提取法、超聲波提取法、微波提取法和酶法，水提法雖然簡單經(jīng)濟，但是多糖的得率較低，超聲波提取法和微波提取法在傳統(tǒng)的方法上多糖提取率有所提升，但是增幅不大，而且對多糖結(jié)構(gòu)也有一定破壞，酶法技術(shù)具有高效、無毒、反應條件溫和等優(yōu)點[9-10]。本實驗采用兩種復合酶分步酶解法獲得營養(yǎng)物質(zhì)，為茶樹菇的深加工提供了理論參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

紫外可見分光光度計，離心分離機，pH 酸度計，電熱恒溫水浴鍋，恒溫干燥箱,微量滴定管，電子分析天平，循環(huán)水式多用真空泵，高速組織粉碎機等。

硫酸為國產(chǎn)分析純；纖維素酶，木聚糖酶，β-葡聚糖酶，木瓜蛋白酶，果膠酶（天津濱海諾奧酶工程技術(shù)有限公司，酶活性：≥80 U/mg）；干茶樹菇子實體（購于市場,制成80 目粉末）。

標準溶液的配制：精確稱取干燥恒重葡萄糖100mg，置于100mL容量瓶中用蒸餾水定容，得濃度為1 mg/mL。葡萄糖貯備溶液，再準確移取20 mL，用蒸餾水定容至100 mL，得0.2 mg/mL 的葡萄糖使用液。

苯酚溶液的配制：苯酚（純苯酚為針狀無色結(jié)晶），水浴加熱后稱取100 g，加鋁片0.10 g、加入氫氧化鈉0.05 g，蒸餾收集178 ℃～182 ℃的餾分，取餾出液10.0 g，加入水190 mL，得5%的苯酚溶液，置于棕色瓶中備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準曲線的繪制

吸取標準溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL 于10 mL 比色管中,分別加入蒸餾水0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3 mL，各加5%的苯酚溶液1 mL 后，再加入濃硫酸5 mL，搖勻放置冷卻，補加蒸餾水到刻度。另取10 mL比色管加入蒸餾水1 mL，加5%的苯酚溶液1 mL，然后加入濃硫酸5mL，按上述方法制得空白溶液，在490nm處測定吸光度。以糖的質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。經(jīng)計算回歸方程為Y=0.0061x-0.006 6，相關(guān)系數(shù)R=0.998 8。

1.2.2 茶樹菇多糖的提取及含量測定

稱取10 g 茶樹菇粉末，置于100 mL 三角燒瓶中，加入蒸餾水10 mL,分別加入各種濃度的酶，并調(diào)節(jié)初始pH、溫度、反應時間，得到茶樹菇提取液。加入3 倍體積的乙醇，靜置于4 ℃冰箱24 h；離心（6 000 r/min、10 min），取沉淀，加10 mL 蒸餾水溶解；Sevag 法[11]除蛋白，取上清液，加水稀釋取樣用苯酚硫酸法[12]測量茶樹菇多糖的含量。

1.2.3 利用復合生物酶制劑分步制取茶樹菇水解液的工藝

2 結(jié)果與分析

2.1 一次酶解過程中水解茶樹菇條件的確定

2.1.1 單因素實驗

采用單因素試驗確定酶濃度，水解時間，初始pH，水解溫度以及料液比對茶樹菇的水解程度，并測定其水解液中多糖的含量，以此選擇復合酶水解試驗的條件依據(jù)。

2.1.1.1 酶添加量對茶樹菇水解影響

每組稱取茶樹菇子實體粉末10 g，料液比1∶10（g/mL），溫度50 ℃，在初始pH 為4.5 時分別加入不同的酶，纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶，添加量分別0.05%，0.10%，0.15%，0.20%，0.25%，酶解2 h，升溫滅酶，檢測水解液中多糖含量，酶添加量對茶樹菇水解液中多糖含量的影響如圖1 所示。

圖1 酶添加量對茶樹菇水解液中多糖含量的影響Fig.1 Enzyme concentration for influence of polysaccharide amount in A.aegirit hydrolysate

如圖1 所示，隨著酶添加量的增加茶樹菇水解液中的多糖含量也隨著增加，當酶添加量增加到0.15%時茶樹菇水解液中的多糖含量也達到峰值，再增加酶添加量茶樹菇水解液中的含量也沒有明顯增加。

2.1.1.2 初始pH 對茶樹菇水解液的影響

每組稱取茶樹菇子實體粉末10 g，料液比1∶10（g/mL），溫度50 ℃，在初始pH 為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 時分別加入纖維素0.15%，木聚糖酶0.15%，β-葡聚糖酶0.20%，進行酶解，酶解2 h，升溫滅酶，檢測水解液中多糖含量，pH 對茶樹菇水解液中多糖含量的影響如圖2 所示。

圖2 pH 對茶樹菇水解液中多糖含量的影響Fig.2 pH for influence of polysaccharide amount in A.aegirit hydrolysate

如圖2 所示，隨著pH 變大茶樹菇水解液中的多糖含量也隨著增加，當pH 達到4.5～5 時茶樹菇水解液中的多糖含量也達到峰值，之后再增大pH 茶樹菇水解液中的多糖含量逐漸降低。

2.1.1.3 酶解時間對茶樹菇水解液的影響

每組稱取茶樹菇子實體粉末10 g，料液比1∶10（g/mL），在溫度50 ℃時分別加入纖維素酶0.15%，木聚糖酶0.15%，β-葡聚糖酶0.20%，進行酶解，在初始pH 為4.5 時，分別酶解1、2、3、4、5 h，升溫滅酶，檢測水解液中多糖含量，酶解時間對茶樹菇水解液中多糖含量的影響如圖3 所示。

圖3 酶解時間對茶樹菇水解液中多糖含量的影響Fig.3 Time for influence of polysaccharide amount in A.aegirit hydrolysate

如圖3 所示，隨著酶解時間的增長茶樹菇水解液中的多糖含量也隨著增加，當酶解時間達到3 h 時茶樹菇水解液中的多糖含量也達到峰值，再延長酶解時間茶樹菇水解液中的含量也沒有明顯增加。

2.1.1.4 酶解溫度對茶樹菇水解液的影響

每組稱取茶樹菇子實體粉末10 g，料液比1∶10（g/mL），在40、45、50、55、60 ℃不同溫度時，分別加入纖維素酶0.15%，木聚糖酶0.15%，β-葡聚糖酶0.20%，進行酶解，在初始pH 為4.5 時酶解2 h，升溫滅酶，檢測水解液中多糖含量，酶解溫度對茶樹菇水解液中多糖含量的影響如圖4 所示。

圖4 酶解溫度對茶樹菇水解液中多糖含量的影響Fig.4 Temperature for influence of polysaccharide amount in A.aegirit hydrolysate

如圖4 所示，隨著酶解溫度增加茶樹菇水解液中的多糖含量也隨著增加，當酶解溫度達到45 ℃～50 ℃時茶樹菇水解液中的多糖含量也達到峰值，之后再增加酶解溫度茶樹菇水解液中的多糖含量逐漸降低。

2.1.1.5 料液比對茶樹菇水解液的影響

每組稱取茶樹菇子實體粉末10 g，在溫度50 ℃時分別加入纖維素酶0.15%，木聚糖酶0.15%，β-葡聚糖酶0.20%，在初始pH 為4.5 時，酶解2 h，分別選擇料液比1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50（g/mL），升溫滅酶，檢測水解液中多糖含量，料液比對茶樹菇水解液中多糖含量的影響如圖5 所示。

圖5 料液比對茶樹菇水解液中多糖含量的影響Fig.5 Material/liquid ratio for influence of polysaccharide amount in A.aegirit hydrolysate

如圖5 所示，隨著料液比增加茶樹菇水解液中的多糖含量也隨著增加，當料液比達到1∶20（g/mL）時茶樹菇水解液中的多糖含量也達到峰值，之后再增大料液比值茶樹菇水解液中的多糖含量逐漸降低。

2.1.2 復合酶I 的正交試驗

由于茶樹菇的細胞壁是由蛋白質(zhì)、幾丁質(zhì)、纖維素組成，較堅固，為了更好地使是蛋白質(zhì)和多糖等溶出，又不使成本過高，采用纖維素酶，β-葡聚糖酶和木聚糖酶共同作用，以提高茶樹菇細胞壁的破碎率。

在使用纖維素酶，木聚糖酶，β-葡聚糖酶共同作用時，由于通過單因素試驗可知纖維素酶，木聚糖酶，β-葡聚糖酶的最佳作用濃度分別為0.15%，0.15%及0.20%，我們以前兩者用量為0.15%作為基準，后者分別以0.15%，0.20%，0.25%，0.30%與之進行復配，在單酶試驗的基礎上，同時又考慮了復合酶I 的水解初始pH，水解時間和水解溫度的影響，選用L16（54）進行正交試驗，正交試驗因素水平如表1。以水解液中多糖含量為考察指標，分析試驗結(jié)果，確定復合酶I 水解茶樹菇的最適條件。

表1 復合酶I 正交試驗L16（54）因素與水平Table 1 the orthogonal experiments of Composite enzyme I factors and level

由表1 可知，各因素的主次順序依次是A、C、B、D、E，最佳的水平條件組合為A4B2C3D2E2。通過正交試驗得到復合酶I 提取茶樹菇多糖的最佳工藝條件為：纖維素酶∶木聚糖酶∶β-葡聚糖酶=3∶3∶6，pH 為5.0，酶解時間2 h，酶解溫度50 ℃，料液比為1∶20（g/mL）。在此條件下茶樹菇水解液中的多糖含量為197.65 mg/g。

2.2 二次酶解水解茶樹菇條件的確定

在使用木瓜蛋白酶，果膠酶共同作用時，以前者用量為0.20%作為基準，后者分別以0.15%、0.20%、0.25%、0.30%的添加量與之合用，在單酶實驗的基礎上，同時又考慮了復合酶II 的水解初始pH，水解時間和水解溫度的影響。以水解液中多糖含量為考察指標，分析試驗結(jié)果，確定復合酶II 水解茶樹菇提取多糖的最適條件。

通過正交試驗得到復合酶II 提取茶樹菇多糖的最佳工藝條件為：木瓜蛋白酶∶果膠酶=4∶6，酶解溫度55 ℃，酶解時間2 h，pH 為4.0，料液比為1∶40（g/mL）。在此條件下茶樹菇水解液中的多糖含量為201.86mg/g。

3 結(jié)論

采用兩種復合酶制劑進行茶樹菇多糖的提取，通過正交試驗篩選出了復合酶制劑的最佳組合：一次酶解的最優(yōu)條件為纖維素酶：木聚糖酶：β-葡聚糖酶=3∶3∶6，pH 為5.0，酶解時間2 h，酶解溫度50 ℃，料液比為1∶20（g/mL）。二次酶解的最優(yōu)條件為木瓜蛋白酶∶果膠酶=4∶6，酶解溫度55 ℃，酶解時間2 h，pH 為4.0，料液比為1∶40。此次實驗，我們采用的復合酶制劑分步水解的方法與其它實驗相比，可以明顯提高多糖的提取率，多糖含量較其它也有顯著升高。比較一二次酶解效果，經(jīng)過二次酶解后多糖含量比一次酶解后的多糖含量沒有明顯的增加，說明二次酶解并沒有使多糖物質(zhì)更多的釋放，但是經(jīng)過二次酶解后其它的生物活性物質(zhì)（如：α-氨基氮等）較一次酶解后都有大幅度的提升。從經(jīng)濟利益方面考慮，最終確定茶樹菇提取多糖的復合酶制劑配方為一次酶解的最優(yōu)條件，即纖維素酶：木聚糖酶：β-葡聚糖酶=3∶3∶6，pH 為5.0，酶解時間2 h，酶解溫度50℃，料液比為1∶20（g/mL）。

[1]鄭毅,余望.茶薪菇人工栽培及營養(yǎng)分析[J].中國食用菌,1999,18(5)：13-14

[2]孔繁祚.糖化學[M].北京：科學出版社,2005：633-648

[3]王小東,毛慧玲,王順啟.真菌多糖的研究進展[J].江西科學,2005,23(3)：243-246

[4]李小定,榮建華,吳謀成.真菌多糖生物活性研究進展[J].食用菌學報,2002,9(4)：50-58

[5]歐陽天贄,李小定,榮建華.真菌多糖抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)作用研究進展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2006,18(3)：524-528

[6]劉棟,錢建亞,卜敏,等.香菇多糖抗腫瘤作用研究現(xiàn)狀[J].中國食用菌,2003,22(2)：6-7

[7]方積年,丁侃.天然藥物-多糖的主要生物活性及分離純化方法[J].中國天然藥物,2007,5(5)：338-347

[8]Tytler,Alexander Fraser.Essay on the Principles of Translation [M].London：Oxford University Press,1986：212-215

[9]趙前程,滕釗,汪秋寬.復合酶法提取海帶多糖的研究[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學學報,2007,38(2)：220-223

[10]Figoli,A,Tagarelli,A,Mecchia,A,et al.Enzyme-assisted pervaporative recovery of concentrated bergamot peel oils[J].Desalination,2006,199：111-112

[11]齊慧玲,魏紹云,王繼倫,等.Sevag 法去除白及多糖中蛋白的研究[J].天津化工,2000(3)：20-22

[12]傅明輝,葉秀儀,郭秀萍,等.茶薪菇子實體多糖的分離純化和抗氧化活性的測定[J].藥物生物技術(shù),2004,11(5)：321-323