高效液相色譜法測定食用菌中甲醛的方法研究

魯燕驊，楊麗仙，牛華，祝紅昆，珠娜

（1.云南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，云南 昆明 650223；2.云南省計(jì)量測試技術(shù)研究院，云南 昆明 650228）

甲醛是一種具有強(qiáng)烈刺激性的無色氣體，易溶于水，其溶液常作為防腐劑。甲醛的稀釋溶液能使細(xì)胞原生質(zhì)的蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆凝固，并能使細(xì)胞的正常機(jī)能受到抑制，甚至破壞，是一種原生質(zhì)毒物。近幾年，我們?cè)谌粘z測工作中發(fā)現(xiàn)有不法從業(yè)者使用甲醛溶液對(duì)食用菌進(jìn)行防腐處理，以延長食用菌的銷售周期，對(duì)食用者的健康產(chǎn)生極大威脅。目前，甲醛的測定方法有：分光光度法，該方法具有操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，其缺點(diǎn)是定性準(zhǔn)確度不夠，易產(chǎn)生假陽性；液相色譜法，均采用樣品直接衍生的處理方式，干擾較大，影響定量的準(zhǔn)確性；氣相色譜法，其缺點(diǎn)是穩(wěn)定性和重現(xiàn)性不夠好。

本方法中樣品經(jīng)水蒸汽蒸餾，得到的蒸餾液經(jīng)柱前衍生，樣品中的甲醛與2，4-二硝基苯肼進(jìn)行衍生化反應(yīng)，生成甲醛-二硝基苯腙，用液相色譜進(jìn)行分離，二極管陣列檢測器外標(biāo)法定量測定，該物質(zhì)在350 nm下有最大吸收。該方法能夠有效降低干擾，準(zhǔn)確度高，精密度好。

1 材料與方法

1.1 設(shè)備

安捷倫HP1100高效液相色譜儀（配二極管陣列檢測器）：安捷倫；蒸餾裝置（含冷凝、接收裝置）。

1.2 試劑

甲醛：標(biāo)準(zhǔn)品，100 mg/L購自國家標(biāo)物中心，使用前根據(jù)檢測要求稀釋成相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；乙腈（色譜純）；2，4-二硝基苯肼（分析純）；磷酸（分析純）；水為超純水（18.2 MΩ）。

1.3 試劑配制

1.3.1 0.3%2，4-二硝基苯肼溶液

稱取0.3 g 2，4-二硝基苯肼，用70 mL 85%磷酸溶解，用乙腈定容至100 mL（2，4-二硝基苯肼預(yù)先用25%乙腈溶液重結(jié)晶，提純。

1.3.2 10%磷酸溶液（體積比）

取10 mL磷酸至100 mL容量瓶，一邊搖動(dòng)一邊緩慢加入水定容至刻度線。

1.4 方法

1.4.1 提取

稱取10 g樣品（精確到0.001 g）于50 mL燒杯中，加水30 mL 10%磷酸10 mL進(jìn)行水蒸汽蒸餾，收集餾出液至100 mL。

1.4.2 衍生

移取上述餾出液10 mL至預(yù)先盛有20 mL乙腈的50 mL容量瓶中，加入0.5 mL 0.3%2，4-二硝基苯肼，用蒸餾水定容至刻度線，常溫下靜置4 h。經(jīng)0.45μm濾膜過濾后待測。

1.4.3 測定色譜條件

色譜柱：C18，200 mm×4.6 mm，5μm；檢測波長：350 nm；流動(dòng)相：乙腈∶水=60∶40；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取

樣品經(jīng)磷酸酸化，水蒸氣蒸餾，已能將樣品中的甲醛完全蒸餾出來，若采用直火蒸餾，會(huì)使食用菌中糖類物質(zhì)分解成甲醛，影響測定結(jié)果。

2.2 衍生化反應(yīng)

2.2.1 反應(yīng)時(shí)間

衍生化反應(yīng)后 2 min、30 min、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)該反應(yīng)在4 h后達(dá)到穩(wěn)定值。

2.2.2 衍生試劑濃度

用0.1%、0.2%濃度的衍生試劑，反應(yīng)12 h后，仍達(dá)不到一個(gè)平衡點(diǎn)，而用0.3%～0.4%濃度的衍生試劑衍生后，反應(yīng)3 h～6 h，反應(yīng)趨于穩(wěn)定狀態(tài)。

2.2.3 衍生化反應(yīng)溫度

分別在 10、20、30、40、60、80 ℃下進(jìn)行衍生化反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)10、20、30℃下衍生化反應(yīng)基本完全，當(dāng)溫度＞40℃時(shí)，衍生反應(yīng)的效率有所下降，故本方法選擇在室溫下進(jìn)行衍生化反應(yīng)。

2.2.4 衍生化反應(yīng)pH

當(dāng)pH小于4時(shí)，可以抑制苯肼成鹽，保留一部分游離堿，使反應(yīng)順利進(jìn)行，通過對(duì)pH為1、2、3、4進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)pH越低，反應(yīng)速度越快，反應(yīng)產(chǎn)物也相對(duì)偏高，但對(duì)于普通C18色譜柱來說，其使用范圍一般在pH 2～10之間，故從檢測效率，儀器維護(hù)，操作方便性等方面考慮，本方法采用0.3%的衍生試劑，pH=3的條件常溫下衍生反應(yīng)4 h后進(jìn)行測定。

2.3 檢測波長的選擇

經(jīng)二極管陣列檢測器波長掃描，甲醛-2，4二硝基苯腙在350 nm處有較大吸收。

2.4 流動(dòng)相的選擇

選用乙腈∶水=60∶40（體積比）為流動(dòng)相，可獲得較好的峰形和適當(dāng)?shù)谋Ａ魰r(shí)間（見圖1），連續(xù)10次進(jìn)樣，保留時(shí)間的RSD＜0.5。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)樣品圖譜Fig.1 Standard sample diagram

2.5 方法線性關(guān)系和檢測限

將甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液分別稀釋成含甲醛：5、10、20、30、40、50μg的系列標(biāo)準(zhǔn)，在本方法所確定的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行測定，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在此范圍內(nèi)，甲醛量與峰面積具有良好的線性關(guān)系，線性方程：y=4.551x+0.507，相關(guān)系數(shù)r=0.9999，甲醛的最小檢出量為2×10-8g，對(duì)于10 g樣品，最低檢出濃度為0.02 mg/kg。

2.6 方法回收率及精密度

分別添加 5.0、20.0、50.0μg甲醛于樣品中，按上述方法連續(xù)測定6次，計(jì)算平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），見表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The recovery rate experiments result

用上述方法對(duì)30批食用菌樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果滿意。

3 結(jié)論

本文綜合了國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中甲醛測定方法的優(yōu)點(diǎn)，建立了一種能夠有效排除干擾、且保持較好準(zhǔn)確度和較高精密度的檢測方法，可以用于食用菌中甲醛含量的日常檢測或結(jié)果驗(yàn)證。

[1]中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.SC/T 3025-2006水產(chǎn)品中甲醛的測定[S].2006：1-6

[2]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.SN/T 1547-2011進(jìn)出口食品中甲醛的測定液相色譜法[S].2011：1-5

[3]浙江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局.DB33/T 555—2005植物源食品中甲醛殘留量的測定高效液相色譜法[S].2005：1-3