低鹽脅迫下仿刺參DD104基因的定量表達(dá)分析

田燚,莫海波,常亞青

(大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧大連116023)

低鹽脅迫下仿刺參DD104基因的定量表達(dá)分析

田燚,莫海波,常亞青

(大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧大連116023)

以2齡仿刺參Apostichopus japonicus為試驗(yàn)材料,利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析了DD104基因在仿刺參不同組織中以及低鹽脅迫后不同時(shí)間的表達(dá)情況。結(jié)果表明:DD104基因在仿刺參管足中的表達(dá)水平最高,在體腔液、觸手、呼吸樹中的表達(dá)水平次之,在體壁、肌肉和腸中的表達(dá)水平較低;仿刺參在受到低鹽脅迫后,體內(nèi)DD104 mRNA的表達(dá)隨鹽度脅迫時(shí)間的增加呈現(xiàn)波動(dòng)性增減,脅迫72 h時(shí)DD104基因的表達(dá)最強(qiáng),在肌肉和管足中的表達(dá)量達(dá)到最大;脅迫48 h時(shí)腸組織中的表達(dá)量最大;脅迫24 h時(shí)體腔液中的表達(dá)量最大。研究表明,低鹽脅迫后DD104基因在仿刺參不同組織中的表達(dá)發(fā)生變化的時(shí)間點(diǎn)不同,低鹽脅迫下DD104基因表達(dá)量的變化規(guī)律說明該基因的表達(dá)可能與滲透脅迫密切相關(guān)。

仿刺參;脅迫;DD104基因;實(shí)時(shí)定量PCR

仿刺參Apostichopus japonicus隸屬于棘皮動(dòng)物門 Echinodermata、海參綱 Holothuroidea、楯手目Aspidochirota、刺參科 Stichopodidae、仿刺參屬Apostichopus。目前,國內(nèi)針對(duì)鹽度變化對(duì)刺參影響的研究主要集中在生長發(fā)育、生化指標(biāo)、能量代謝、生存極限和適應(yīng)能力等方面[1-5],研究認(rèn)為,刺參在其最適溫度 (15℃)條件下具有一定的滲透壓調(diào)節(jié)能力。國外針對(duì)海參滲透調(diào)節(jié)的研究較為深入[6],研究認(rèn)為,外環(huán)境變化引起海參體腔液滲透壓改變,從而改變海參細(xì)胞的離子運(yùn)輸[7]及相關(guān)酶的活性[8]。海參的排臟是其對(duì)低鹽度環(huán)境的適應(yīng),Fankboner[9]研究表明,海參的排臟大多發(fā)生在秋季多雨的季節(jié),排臟可以增強(qiáng)海參對(duì)多雨導(dǎo)致的海水鹽度降低的抵抗力,紅海參主要通過排臟以減小體表面積和體質(zhì)量來應(yīng)對(duì)低鹽度帶來的滲透壓調(diào)節(jié)的壓力。Foglietta等[10]研究發(fā)現(xiàn),海參呼吸樹細(xì)胞遵守范托夫滲透法則,具有良好的滲透調(diào)節(jié)能力。哇巴因?qū)a+/K+離子泵的抑制作用使得細(xì)胞內(nèi)鉀離子減少,鈉離子增多[11],在海水鹽度改變時(shí)細(xì)胞仍能較好地進(jìn)行滲透調(diào)節(jié),不改變細(xì)胞容積。

目前,國內(nèi)外對(duì)耐鹽抗逆相關(guān)基因的研究相對(duì)較少,主要集中于對(duì)鈉鉀ATP酶基因的研究[12-13]。關(guān)于DD104基因的研究相對(duì)較少,有研究表明, DD104基因及蛋白與免疫防御密切相關(guān),在LPS和細(xì)菌的刺激下均出現(xiàn)表達(dá)上調(diào),并且在刺參個(gè)體不同發(fā)育時(shí)期均有表達(dá)[14-15]。

近年來,池塘養(yǎng)殖刺參在中國北方沿海迅速發(fā)展,成為許多地區(qū)的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè),但在夏天雨季和冬季冰凍災(zāi)害情況下,近海池塘和圍堰養(yǎng)殖刺參容易受到降雨影響而導(dǎo)致鹽度降低,造成刺參發(fā)病、死亡,給海參養(yǎng)殖業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。刺參疾病防御及對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力的研究工作已成為當(dāng)務(wù)之急。本研究中,以仿刺參為試驗(yàn)材料,利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)低鹽脅迫下DD104基因在仿刺參不同組織中的表達(dá)情況進(jìn)行研究,旨在從分子水平上研究刺參在逆境脅迫中的應(yīng)答機(jī)制,為進(jìn)一步研究該基因在鹽度調(diào)節(jié)適應(yīng)機(jī)制中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用2齡仿刺參取自大連海洋大學(xué)北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

主要試劑Trizol、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、Marker(DL2000)、dNTP、ExTaq DNA聚合酶、pMD19-T Vector、HindIII、BamHI購自寶生物工程 (大連)有限公司,PCR引物由寶生物公司合成。AXYGEN柱式凝膠回收試劑盒、AXYGEN小量質(zhì)粒提取試劑盒均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 分別取仿刺參不同組織,按Trizol法提取總RNA。采用紫外分光光度計(jì)與10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的濃度及完整性,-80℃下保存?zhèn)溆谩Ｊ褂肕-MLV反轉(zhuǎn)錄cDNA,反轉(zhuǎn)錄體系:總RNA 100 ng,oligo(dT)1 μL,5×M-MLV Buffer 2 μL,dNTP Mixture(各10 mmol/L)0.5 μL,40 U/μL RNase Inhibitor 0.25 μL,200 U/μL RTase M-MLV 0.25 μL,用RNasefree水定容至10 μL。反應(yīng)條件:42℃下水浴30 min,95℃下變性5 min。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件,根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的DD104片段,設(shè)計(jì)兼并引物DD104-F和DD104-R。綜合考慮熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)原則,對(duì)仿刺參DD104基因設(shè)計(jì)熒光定量用引物,首先進(jìn)行普通PCR檢測,篩選出特異性好、條帶單一、無引物二聚體的引物用于后續(xù)試驗(yàn),再用熒光定量PCR檢測引物的特異性[16]。試驗(yàn)用引物見表1。

表1 引物序列Tab.1 The sequences of primers

1.2.3 DD104基因的定量表達(dá)

1)不同組織中的表達(dá)。分別取健康仿刺參的體腔液、觸手、管足、腸、呼吸樹、肌肉和體壁組織,提取 RNA,經(jīng) DNase I處理后反轉(zhuǎn)錄制備cDNA模板,每次取樣3個(gè)個(gè)體,每種組織均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

2)低鹽脅迫后基因的表達(dá)規(guī)律。分別提取對(duì)照組和低鹽脅迫組中的體腔液、管足、腸、肌肉4個(gè)組織的總RNA,合成cDNA第一鏈,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3頭仿刺參,每種組織設(shè)置3個(gè)重復(fù)。利用引物DD104-F和DD104-R對(duì)樣品進(jìn)行擴(kuò)增,用cytb-F和cytb-R作內(nèi)參引物。PCR反應(yīng)條件為: 94℃下預(yù)變性5 min;94℃下變性30 s,60℃下退火30 s,72℃下延伸30 s,共進(jìn)行28個(gè)循環(huán);最后在72℃下延伸5 min,并于4℃下保存?zhèn)溆?。?duì)于任意一個(gè)樣品,目標(biāo)基因 (DD104基因)和內(nèi)參基因 (cytb基因)擴(kuò)增時(shí)加入等量模板,利用2-ΔΔCt分析其定量表達(dá)結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用 ABI Real-time分析軟件進(jìn)行分析。DD104基因表達(dá)相對(duì)濃度的計(jì)算公式為

其中:Ct為熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的域值時(shí)經(jīng)歷的循環(huán)數(shù);CtA為目的基因的Ct值;CtB為內(nèi)參基因的Ct值;ExA為目的基因的擴(kuò)增效率;ExB為內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率。

表達(dá)量結(jié)果用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行顯著性分析,顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 定量引物的驗(yàn)證

DD104和cytb基因的熔解曲線分別在82.61℃和80.37℃時(shí)出現(xiàn)一個(gè)熔解峰值。在熔解溫度之前均未有小峰值出現(xiàn),可以推測其引物二聚體沒有形成,引物的設(shè)計(jì)適合用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR。

2.2 仿刺參DD104基因在不同組織中的表達(dá)

利用實(shí)時(shí)定量PCR方法分析了DD104基因在仿刺參不同組織中的表達(dá) (圖1)。從圖1可見: DD104基因在管足中的表達(dá)水平最高,且顯著高于其他各組織 (P＜0.05),在體腔液、觸手、呼吸樹中的表達(dá)水平次之,在體壁、肌肉和腸中的表達(dá)水平均較低。

2.3 低鹽脅迫后DD104基因在不同組織中的表達(dá)規(guī)律

采用Real-time PCR方法分析低鹽脅迫后不同時(shí)間段DD104基因在肌肉組織中的表達(dá)情況 (圖2)。從圖2可見:低鹽脅迫1.5～48 h時(shí),肌肉組織中DD104基因的表達(dá)量顯著高于0 h(空白組) (P＜0.05);低鹽脅迫72 h時(shí),DD104基因的表達(dá)水平是空白組的829倍,且極顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平 (P＜0.01)。

圖1 DD104基因在仿刺參不同組織中的表達(dá)Fig.1 Quantitative Real-time PCR analysis of DD104 gene expression in different tissues from the sea cucumber Apostichopus japonicus

圖2 低鹽脅迫后不同時(shí)間段DD104基因在仿刺參肌肉組織中的表達(dá)差異Fig.2 Quantitative Real-time PCR analysis of DD104 gene expression in muscle from different time under salt stress in the sea cucumber A.japonicus

從圖3可見:在低鹽脅迫72 h時(shí),管足組織中DD104基因的表達(dá)水平是空白組的214倍,且極顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量 (P＜0.01);低鹽脅迫6 h、48 h時(shí),DD104基因的表達(dá)量顯著高于低鹽脅迫 0、1.5、3、12、24 h的表達(dá)量 (P＜0.05)。

從圖4可見:低鹽脅迫3 h和48 h時(shí),體腔液中的DD104基因的表達(dá)量與空白組差異不明顯(P＞0.05);低鹽脅迫1.5、6、12 h時(shí),表達(dá)量顯著低于空白組 (P＜0.05),低鹽脅迫24、72 h時(shí),表達(dá)水平最高,且顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量(P＜0.05)。

從圖5可見:低鹽脅迫后48 h時(shí),腸組織中的DD104基因的表達(dá)量是空白組的25倍,且極顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量 (P＜0.01),而其他時(shí)間點(diǎn)的基因表達(dá)量均無顯著性差異 (P＞0.05)。

圖3 低鹽脅迫后不同時(shí)間段DD104基因在仿刺參管足組織中的表達(dá)差異Fig.3 Quantitative Real-time PCR analysis of DD104 gene expression in tube feet from different time under salt stress in the sea cucumber A.japonicus

圖4 低鹽脅迫后不同時(shí)間段DD104基因在仿刺參體腔液中的表達(dá)差異Fig.4 Quantitative Real-time PCR analysis of DD104 gene expression in coelomic fluid from different time under salt stress in the sea cucumber A.japonicus

圖5 低鹽脅迫后不同時(shí)間段DD104基因在仿刺參腸組織中的表達(dá)差異Fig.5 Quantitative Real-time PCR analysis of DD104 gene expression in intestine of the sea cucumber A.japonicus at different time under salt stress

3 討論

鹽度是影響水產(chǎn)動(dòng)物機(jī)體生理反應(yīng)的重要環(huán)境因子之一,不同鹽度下水產(chǎn)動(dòng)物表現(xiàn)出不同的適應(yīng)狀態(tài)。刺參屬于狹鹽性海洋生物,分布區(qū)域的鹽度一般為28～34,對(duì)鹽度的耐受范圍狹小,海水鹽度一旦超出刺參的耐受范圍,就會(huì)大量死亡[17-22]。李慶彪等[17]研究表明,仿刺參在鹽度低于10和高于40時(shí),不能生存。鹽度對(duì)仿刺參免疫功能、呼吸及排泄等影響國內(nèi)外已有報(bào)道。以往有關(guān)鹽度對(duì)刺參影響的研究主要集中在最適鹽度的探討,如不同淡化方式對(duì)刺參存活和生長的影響,鹽度對(duì)能量收支及轉(zhuǎn)換的影響,鹽度對(duì)刺參的呼吸代謝、營養(yǎng)需求、滲透調(diào)節(jié)、免疫力和抗逆性等方面的影響[17,23-25]。

DD104是一種與免疫相關(guān)的基因,首先發(fā)現(xiàn)于海膽的體腔液細(xì)胞中[26]。有研究表明,DD104基因與生物機(jī)體的健康狀況、免疫保護(hù)、環(huán)境應(yīng)激等相關(guān),可用來評(píng)判機(jī)體非特異性免疫的能力[27],是刺參防御系統(tǒng)的重要基因。在本試驗(yàn)中,通過實(shí)時(shí)定量PCR試驗(yàn)證實(shí)仿刺參在受到低鹽脅迫后,體內(nèi)DD104 mRNA隨低鹽脅迫時(shí)間的增加呈現(xiàn)出波動(dòng)狀態(tài),低鹽脅迫72 h時(shí)DD104基因表達(dá)最強(qiáng),在肌肉和管足中的表達(dá)量達(dá)到最大;低鹽48 h時(shí)腸組織中的DD104表達(dá)量最大;低鹽24 h時(shí)體腔液中的DD104表達(dá)量最大。推測這是因?yàn)殡S著低鹽脅迫時(shí)間的增加,仿刺參生命體滲透壓發(fā)生改變,從而水體中的大量細(xì)菌進(jìn)入仿刺參體內(nèi),造成免疫力下降,為了消除菌體的傷害,誘導(dǎo)DD104的表達(dá)發(fā)生變化,以提高自身免疫力。這與Rast等[26]報(bào)道的海膽體內(nèi)DD104基因在細(xì)菌和創(chuàng)傷刺激下表達(dá)量發(fā)生變化的結(jié)果相符。DD104基因在低鹽脅迫下表達(dá)發(fā)生變化,說明它的表達(dá)可能與滲透脅迫密切相關(guān)。在低鹽脅迫下,仿刺參的DD104基因表達(dá)情況總體上顯著高于正常狀態(tài)下的表達(dá)水平,這說明仿刺參的非特異性免疫在受到刺激時(shí)基因表達(dá)上調(diào),以應(yīng)對(duì)外界刺激。龔海濱等[20]研究了仿刺參在較低鹽度海水中的耐受能力,結(jié)果表明,在鹽度為15的海水中,仿刺參出現(xiàn)了不適狀態(tài),在鹽度脅迫72 h時(shí)達(dá)到最低點(diǎn),隨著時(shí)間的推移,仿刺參逐步適應(yīng)了鹽度為15的海水環(huán)境;在鹽度為20的海水中,也出現(xiàn)了類似情況,仿刺參在鹽度脅迫36 h內(nèi)出現(xiàn)了不適狀態(tài),隨著時(shí)間的推移,仿刺參逐步適應(yīng)了鹽度為20的海水環(huán)境。仿刺參在鹽度為15和40環(huán)境中生長一段時(shí)間后,就會(huì)逐步適應(yīng)其所生長的環(huán)境。仿刺參對(duì)較低和較高鹽度海水的耐受能力隨著時(shí)間的推移,呈現(xiàn)出一定規(guī)律性,其規(guī)律性表現(xiàn)為:不適應(yīng)——最不適——逐步適應(yīng)——適應(yīng)[20],這與本研究結(jié)果相符。鄭萍萍[28]在研究鹽度脅迫對(duì)三疣梭子蟹血清非特異性免疫因子的影響中,得到的結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

在低鹽脅迫下,棘皮動(dòng)物排氨率的升高被認(rèn)為是在細(xì)胞內(nèi)滲透壓調(diào)節(jié)期間,游離氨基酸的分解作用導(dǎo)致了氨氮排泄量的凈增加[29]。王吉橋等[3]研究了鹽度驟降對(duì)不同發(fā)育階段仿刺參存活和生長的影響,結(jié)果表明,由正常鹽度33降到鹽度20后,試驗(yàn)組存活率隨時(shí)間的增加而升高。本試驗(yàn)中仿刺參不同組織中DD104基因的表達(dá)量分別在低鹽脅迫后48 h、72 h時(shí)達(dá)到最高峰。王吉橋等[3]的養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)果與本試驗(yàn)中對(duì)DD104基因表達(dá)量的研究結(jié)果相符合。

[1]呂偉志,戴曉軍,李東站.低鹽海水池塘養(yǎng)殖刺參試驗(yàn)[J].齊魯漁業(yè),2006,23:3-4.

[2]陳勇,高峰,劉國山,等.溫度、鹽度和光照周期對(duì)刺參生長及行為的影響[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2007,31:687-691.

[3]王吉橋,張?bào)丬?姜玉聲,等.鹽度驟降對(duì)不同發(fā)育階段仿刺參存活和生長的影響[J].大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,24(1):139-145.

[4]袁秀堂,楊紅生,周毅,等.鹽度對(duì)刺參(Apostichopus japonicus)呼吸和排泄的影響[J].海洋與湖沼,2006,37(4):348-354.

[5]孟雷明,王麗麗,雷艷,等.鹽度對(duì)刺參碳、氮收支影響的初步研究[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào),2013,28(1):34-48.

[6]Vidolin D,Ivonete A,Santos A.Osmotic stability of the coelomic fluids of a sea-cucumber(Holothuria grisea)and a starfish(Asterina stellifera)(Echinodermata)exposed to the air during low tide:a field study[J].Acta Biol Par Curitiba,2002,31(1/4): 113-121.

[7]Herrera F C,Herrera M I,Lopez I.Further studies on the partial double Donnan.Is isosmotic KCl solution isotonic with cells of respiratory trees of the holothurian Isostichopus badionotus Selenka? [J].Journal of Experimental Marine Biology and Ecology,2000, 247:139-152.

[8]謝忠明.海參海膽?zhàn)B殖技術(shù)[M].北京:金盾出版社,2004:56-57.

[9]Fankboner P.Seasonal visceral atrophy and response to salinity by Parastichopus californicus(Stimpson):Osmoregulation[J]. Beche-de-mer Information Bulletin,2002,17:22-26.

[10]Foglietta L M,Herrera F C.Ionosmotic response of respiratory trees of the holothurian Isostichopus badionotus Selenka preincubated in hyper-,iso-and hypo-osmotic seawater[J].Journal of Experimental Marine Biology and Ecology,1996,202(2):151-164.

[11]Haddad P,Beck J S,Boyer J L,et al.Role of chloride ions in liver cell volume regulation[J].Am J Physiol,1991,261(2):340-348.

[12]侯彥峰,張照斌,胡建英.皮質(zhì)醇影響青鳉鰓內(nèi)鈉鉀ATP酶基因表達(dá)的研究[J].生態(tài)毒理學(xué)報(bào),2009,4(2):212-217.

[13]馮平,王峰,范光麗.鹽度對(duì)青鳉魚腸內(nèi)Na+-K+-ATPase基因表達(dá)的影響[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2006,15(6):24-27.

[14]Yang Aifu,Zhou Zunchun,Dong Ying,et al.Expression of immune-related genes in embryos and larvae of sea cucumber Apostichopus japonicus[J].Fish&Shellfish Immunology,2010,29: 839-845.

[15]Ramírez-Gómez F,Ortíz-Pineda P A,Rojas-Cartagena C,et al. Immune-related genes associated with intestinal tissue in the sea cucumber Holothuria glaberrima[J].Immunogenetics,2008,60: 57-71.

[16]劉俊,趙金良,張敏,等.鱖胰島素樣生長因子-ⅡcDNA基因的克隆與表達(dá)特征[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào),2012,26(6):495-501.

[17]李慶彪,邱兆星.無公害刺參標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2003:88-89.

[18]隋錫林.刺參增養(yǎng)殖[M].北京:農(nóng)業(yè)出版社,1985:13-14.

[19]趙斌,李成林,胡煒,等.低溫對(duì)不同規(guī)格刺參幼參生長與耗氧率的影響[J].海洋科學(xué),2011,35(12):88-91.

[20]龔海濱,王耀兵,鄧歡,等.仿刺參對(duì)鹽度的耐受能力研究[J].水產(chǎn)科學(xué),2009,28(5):284-286.

[21]陳愛華.環(huán)境因子對(duì)刺參的影響及對(duì)策[J].河北漁業(yè),2007 (3):19-22.

[22]張少華,張秀麗,劉振林,等.刺參對(duì)鹽度的適應(yīng)范圍試驗(yàn)[J].齊魯漁業(yè),2004,21(12):9-10.

[23]Trotter J A,Salgado J P,Koob T J.Mineral content and salt dependent viscosity in the dermis of the sea cucumber Cucumaria frondosa[J].Com Biochem Physiol,1997,116(4):329-335.

[24]Asha P S,Muthiah P.Effects of temperature,salinity and pH on larval growth,survival and development of the sea cucumber Holothuria spinifern Thee[J].Aquaculture,2005,250:823-829.

[25]Dong Yunwei,Dong Shuanglin,Meng Xianliang.Effects of thermal and osmotic stress on growth,osmoregulation and Hsp70 in sea cucumber(Apostichopus japonicus Selenka)[J].Aquaculture,2008, 276:179-186.

[26]Rast J P,Amore G,Calestani C,et al.Recovery of developmentally defined gene sets from high-density cDNA macroarrays[J].Developmental Biology,2000,228:270-286.

[27]孔樣會(huì),王桂忠,艾春香,等.鋸緣青蟹不同器官組織中總抗氧化能力和SOD活性的比較研究[J].臺(tái)灣海峽,2003,22 (4):469-474.

[28]鄭萍萍.鹽度脅迫對(duì)三疣梭子蟹血清非特異性免疫因子的影響[J].水產(chǎn)科學(xué),2010(11):634-638.

[29]Diehl W J.Osmoregulation in echinoderms[J].Comp Biochem Physiol,1986,84A:199-205.

Expression of DD104 gene in sea cucumber Apostichopus japonicus under salinity stress

TIAN Yi,MO Hai-bo,CHANG Ya-qing
(Key Laboratory of Mariculture&Stock Enhancement in North China's Sea,Ministry of Agriculture,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

To understand the molecular level of the Stress Response Mechanism in sea cucumber Apostichopus japonicus(2 year old),the trial use sea cucumber as experimental material and use Real-time quantitative PCR technology to study DD104 gene in sea cucumber in different tissues and low salinity stimulation to analyze the expression of DD104 gene.The results of Real-time quantitative PCR show that DD104 have the highest expression in the tube feet under normal circumstances;Then it has higher expression in body cavity fluid,tentacles and respiratory tree.At last,it has a small amount of expression in intestine,body wall and the muscle.Under lower salinity stress,DD104 mRNA in sea cucumber was fluctuant.The highest gene expression in tube feet and muscle emerged at 72 hour.The maximum expression in intestine tissue appeared at 48 hour and at 24 hour emerge the maximum expression in body cavity fluid.The test results showed that in the process of sea cucumber in low salinity stress, DD104 gene in different tissues expression changed as time was different.The regular pattern of DD104 expression in low salinity stress was possible closely related with osmotic stress.

Apostichopus japonicus;stress;DD104 gene;qRT-PCR

S917.4

A

2012-10-18

國家 “863”計(jì)劃項(xiàng)目 (2012AA10A412);國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (31072230,41106128)

田燚 (1979-),女,博士,副教授。E-mail:tianyi@dlou.edu.cn

常亞青 (1967-),男,博士,教授。E-mail:yqchang@dlou.edu.cn

2095-1388(2013)03-0236-05