基于石英晶體微天平傳感的ELISA測(cè)定水體中殘留氯霉素

周亞民 葉領(lǐng)云

(東莞理工學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，廣東東莞 523808)

氯霉素(CAP)是一類廣譜抗生素，常用于動(dòng)物各種傳染性疾病的治療，對(duì)多種病原菌有較強(qiáng)的抑制作用，曾在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中得到廣泛應(yīng)用，同時(shí)也帶來了水產(chǎn)品中氯霉素殘留的嚴(yán)重問題〔1－3〕。氯霉素對(duì)人的造血系統(tǒng)、消化系統(tǒng)具有嚴(yán)重的毒性反應(yīng)，有可能引發(fā)人的再生障礙性貧血，還會(huì)引起視神經(jīng)炎、皮疹等不良反應(yīng)。在美國僅允許氯霉素應(yīng)用于非食用性動(dòng)物，規(guī)定在任何動(dòng)物性食品中不得檢出氯霉素。歐共體禁止氯霉素應(yīng)用于產(chǎn)奶母牛和產(chǎn)蛋雞，在其他動(dòng)物性食品中的含量也做了限制。目前常用的檢測(cè)氯霉素的方法有液相色譜法、放射免疫分析法、酶聯(lián)免疫分析法〔4－11〕。高效液相色普法操做復(fù)雜，檢測(cè)周期長，免疫分析法具有專業(yè)性好，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)〔12－16〕。

壓電傳感器是一種對(duì)質(zhì)量變化非常敏感的石英晶體微天平，厚度剪切壓電石英晶體頻移(ΔF)與晶體表面均勻吸附的極薄層物質(zhì)質(zhì)量(ΔM)存在正比例關(guān)系?；诿复呋孜锓磻?yīng)生成沉淀使晶片諧振頻率降低，石英晶體微天平可以用于酶的分析。壓電免疫傳感器技術(shù)一般是把抗體固定在壓電石英晶體表面上，依據(jù)免疫反應(yīng)引起的質(zhì)量及界面粘彈性變化來進(jìn)行分析。本文基于石英晶體微天平作轉(zhuǎn)換器的ELISA 用于測(cè)量氯霉素的濃度。HRP－CAP 作標(biāo)記物，抗CAP 抗體通過氨基硅烷化試劑和2－氨基乙硫醇層固定在石英晶片表面上，采用競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)吸附免疫分析形式，以TMB 作酶的底物。結(jié)合在晶片上的酶標(biāo)物催化底物氧化形成二聚體沉淀使石英晶體諧振頻率降低，據(jù)此測(cè)量酶標(biāo)物HRP－CAP 和待測(cè)物的CAP 量。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

CN3165 型高分辨計(jì)數(shù)器(石家莊無線電四廠)，石英晶體諧振器(北京七0 七廠):AT 切型，9 MHz 雙面鍍金電極，晶片直徑12 mm，電極直徑6 mm，諧振電路為自制TTL－IC 電路，CS501 型超級(jí)恒溫器(重慶實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)，氯霉素、酶標(biāo)氯霉素、氯霉素抗體購自深圳市博奧通科有限公司，γ－氨丙基三乙基硅烷，2－氨基乙硫醇，3，3，5，5－四甲基聯(lián)苯胺，HRP 購自Sigma 公司。培育溶液為含1%BSA 的和1 mM EDTA 的0.1 M 的磷酸鹽緩沖液，洗液為PH = 7.4 的0.1 M 的PBS 溶液 酶底物溶液為含0.5 mM TMB 和1 mM H2O2的pH 5.0 的磷酸鹽緩沖液。不同濃度的CAP 和HRP－CAP 溶液用含有1%(w/w)的牛血清蛋白的0.1 M tris－HCl 緩沖溶液稀釋標(biāo)準(zhǔn)CAP 和HRP－CAP 溶液而得。

1.2 CAP 抗體的固定方法

石英晶片依次用丙醇浸泡10 分鐘，1∶1 的乙醇濃鹽酸中浸泡30 分鐘，濃硫酸中浸泡30 分鐘，5 M氫氧化鈉浸泡10 分鐘，用蒸餾水漂洗后，干燥，浸入2%的3－氨基丙基三乙氧基硅烷化試劑的無水乙醇溶液中，20 分鐘后用無水乙醇沖洗干凈。在105℃環(huán)境下加熱1 小時(shí)，得到富含NH2基的表面，然后在2－氨基乙硫醇溶液中自組裝6 小時(shí)，用蒸餾水清洗晶片，然后用3%的戊二醛PBS 溶液活化三小時(shí)，洗去游離的戊二醛，將100 μL 體積的的CAP 抗體溶液涂覆在戊二醛活化過的晶片上，在冰箱中過夜，洗去游離的抗體后，用0.5 mg·mL－1的新配置的NaBH4溶液還原戊二醛與氨基形成的席夫堿以穩(wěn)定蛋白質(zhì)修飾層。最后晶片用PBS 清洗放入4℃冰箱中保存。

1.3 免疫分析過程

免疫分析采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA 方法，如圖1 所示，晶片用100 μL 包含HRP－CAP 和CAP 的培育溶液培育，使待測(cè)的CAP 與HRP－CAP 競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到固定在晶片上的抗CAP 抗體上。用洗液洗去游離的CAP 及HRP－CAP 后，將晶片放入pH = 5.0 的磷酸緩沖溶液中，并注入TMB 溶液，頻率穩(wěn)定后，記下頻率值F1，加入H2O2，記錄頻率F2，在5 分鐘內(nèi)的頻移變化值ΔF = F1－F2用來確定結(jié)合在晶片上HRPCAP 的量，從而間接測(cè)定溶液中CAP 的濃度。

圖1 測(cè)定氯霉素競(jìng)爭(zhēng)免疫分析法分析程序

1.4 傳感器敏感面的再生方法

測(cè)試完成后，用50% 的二甲基亞砜水溶液溶解沉淀，然后用pH=2.3 的甘氨酸－鹽酸緩沖溶液洗滌，解離晶體表面上免疫復(fù)合物，并洗去CAP 和HRP－CAP，從而使免疫傳感器敏感面得到再生。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗體固定效果評(píng)價(jià)

對(duì)CAP 抗體固定效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，同樣的條件，通過3－氨基丙基三乙氧基硅烷化試劑將抗體固定在石英晶體微天平表面制成免疫傳感器，通過3－氨基丙基三乙氧基硅烷化試劑和2－氨基乙硫醇將抗體固定在石英晶體微天平表面制成免疫傳感器。固定有抗CAP 抗體的石英晶片用0.5 μg·L－1的HRP－CAP 培育50 分鐘，用PBS 溶液沖洗三次，洗去非特異性吸附的酶標(biāo)物，浸入0.5 mM TMB 的PBS 溶液中，待晶片諧振頻率穩(wěn)定后，加入H2O2，并記錄石英晶片的諧振頻率。作為對(duì)比，未用酶標(biāo)物培育的石英晶片在同樣濃度的TMB 和H2O2溶液中，并監(jiān)測(cè)石英晶體的諧振頻率。如圖2 所示，傳感器經(jīng)酶標(biāo)物CAP 培育后，在TMB+ H2O2底物溶液中，晶片諧振頻率不斷降低，這是因?yàn)榻?jīng)過免疫反應(yīng)，CAPHRP 結(jié)合在晶片上，它能催化TMB(1)與H2O2反應(yīng)在晶片形成沉淀(2)。而未經(jīng)CAP－HRP 培育的晶片在TMB + H2O2溶液中，晶片諧振頻率基本保持不變。這說明在酶催化質(zhì)量放大的石英晶體微天平傳感器中，TMB 作為HRP 的底物能有效地檢測(cè)HRP。通過3－氨基丙基三乙氧基硅烷化試劑將抗體固定在石英晶體微天平表面制成免疫傳感器的頻率響應(yīng)值為57 Hz，同樣條件下通過3－氨基丙基三乙氧基硅烷化試劑和2－氨基乙硫醇將抗體固定在石英晶體微天平表面制成免疫傳感器頻率響應(yīng)值為82 Hz，說明通過有機(jī)硅烷試劑和2－氨基乙硫醇自組裝可以在石英晶體微天平的金電極表面固定更多的CAP 抗體，免疫傳感器有更大的響應(yīng)。

圖2 傳感器頻率響應(yīng)與時(shí)間關(guān)系

2.2 培育溶液pH 值的影響

免疫分析過程中，溶液pH 值影響蛋白質(zhì)荷電性，從而影響抗體對(duì)抗原結(jié)合力。在pH 為5.5 ～8.5的范圍里考察了培育溶液pH 值對(duì)傳感器響應(yīng)的影響，如圖3 所示，傳感器在0.7 μg·mL－1HRP－CAP培養(yǎng)液里培育50 分鐘，pH=7.0 ～7.5 的培育溶液最有利于免疫反應(yīng)。在pH 高于7.5 或pH 低于6.5的溶液中培育，傳感器的響應(yīng)均較低。實(shí)驗(yàn)中選用pH =7.5 的磷酸鹽緩沖溶液作為培育溶液用來分析CAP 的濃度。

2.3 HRP－CAP 用量的影響

傳感器的響應(yīng)大小與其表面上酶標(biāo)物的量相關(guān)，培育液中酶標(biāo)物的濃度影響結(jié)合到傳感器表面上的酶標(biāo)物的量。為了用較少量的酶標(biāo)物去獲得較大的響應(yīng)，考察了培育溶液中酶標(biāo)物濃度對(duì)傳感器響應(yīng)的影響。如圖4 所示，傳感器在不同濃度的HRP－CAP 培養(yǎng)液里培育50 分鐘，培育溶液中酶標(biāo)用量增加，傳感器響應(yīng)增大。基于傳感器有較大的響應(yīng)，并用較少的酶標(biāo)物用量，一個(gè)包含0.4 μg·mL－1酶標(biāo)物的培育液用來測(cè)定CAP。

圖3 培育溶液pH 對(duì)傳感器電流響應(yīng)的影響

圖4 培育溶液中HRP－CAP 濃度對(duì)傳感器電流響應(yīng)的影響

2.4 培育時(shí)間的影響

在傳感器表面上，抗原抗體發(fā)生免疫反應(yīng)形成免疫復(fù)合物需要一定時(shí)間。實(shí)驗(yàn)考察了培育時(shí)間對(duì)傳感器響應(yīng)的影響，傳感器在含0.4 μg·mL－1HRP－CAP 和0.4 μg·mL－1CAP 的培育液中培育不同時(shí)間并測(cè)量頻率響應(yīng)，如圖5 所示，傳感器在0.7 μg·mL－1HRP－CAP 培養(yǎng)液里培育不同時(shí)間，傳感器的響應(yīng)隨培育時(shí)間增加而增大，30 分鐘達(dá)到平衡，因此在實(shí)驗(yàn)中取40 分鐘作為培育時(shí)間。

圖5 培育時(shí)間對(duì)傳感器電流響應(yīng)的影響

圖6 傳感器頻率響應(yīng)與氯霉素濃度對(duì)數(shù)值的關(guān)系

2.5 傳感器的響應(yīng)曲線及初步應(yīng)用

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件測(cè)定了傳感器的工作曲線，如圖6 所示，培育液中CAP 濃度高，復(fù)合到傳感器表面的HRP－CAP 量的就少，結(jié)果傳感器頻率變化值也少。在0.3 ～180 μg·L－1CAP 范圍內(nèi)，傳感器的響應(yīng)與CAP 濃度的對(duì)數(shù)有近似的線形關(guān)系。

2.6 測(cè)定的選擇性

研究了環(huán)境樣品中存在60 μg·L－1的CAP 時(shí)，常見干擾物質(zhì)氯霉素堿、四環(huán)素、甲基氯霉素、慶大霉素、青霉素、紅霉素、強(qiáng)力霉素、氟甲砜霉素、已酰氯霉素、甲砜氯霉素對(duì)測(cè)定CAP 的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1 所示。，當(dāng)干擾物質(zhì)環(huán)境毒素與環(huán)境樣品CAP 的濃度比為10 時(shí)，大多數(shù)可能共存的環(huán)境抗生素產(chǎn)生的相對(duì)誤差在5%以下;只有氯霉素堿和氟甲砜霉素帶來的的相對(duì)誤差大于5%。當(dāng)干擾物質(zhì)與環(huán)境水中CAP 的濃度比為100 時(shí)，大多數(shù)共存環(huán)境抗生素產(chǎn)生的相對(duì)誤差在11%以下;只有氯霉素堿帶來的相對(duì)誤差超過11%，表明該方法對(duì)AFB1 具有很好的選擇性。

表1 干擾物質(zhì)對(duì)CAP 分析的影響

3 結(jié)語

本文描述了以石英晶體微天平作傳感裝置的ELISA 法用于分析水體中CAP 的含量。采用競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)吸附免疫分析形式，以HRP－CAP 作標(biāo)記物，TMB 和H2O2作酶的底物，通過辣根過氧化酶催化氧化TMB 生成沉淀，使石英片諧振頻率降低，來測(cè)定酶標(biāo)物和待測(cè)物的濃度。免疫傳感器對(duì)CAP 的檢測(cè)范圍為0.3 ～180 μg·L－1，可以滿足水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)中水質(zhì)檢測(cè)的相關(guān)要求，它具有裝置簡單，測(cè)量方便，靈敏度高等特點(diǎn)。

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