益智仁提取物對小鼠生精能力的影響實驗研究

范 欣，賈 燕，孫欣慧，何立東，尤思淼，楊曉晨，夏焱慧，王麗娜，劉 微(吉林醫(yī)藥學(xué)院:.護理學(xué)院，2.藥理學(xué)教研室，吉林 吉林 3203)

隨著社會工業(yè)的不斷發(fā)展，不育夫婦的總發(fā)病率明顯升高。2004年歐洲生殖協(xié)會統(tǒng)計:育齡夫婦一年內(nèi)不能懷孕者占25%，其中15%尋求治療，男方因素引起不育占50%［1］。目前有相當一部分男性不育癥的病因不明確，治療上以經(jīng)驗治療為主，療效不確定，治療機制也多不明了。

祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)在治療男性不育方面具有較好經(jīng)驗，部分具有生精壯陽功效的中藥或組方藥在男性不育治療上具有療效穩(wěn)定、毒副作用小的特點，并取得了較好的效果。研制和開發(fā)中藥有效成分，治療男性不育有良好的應(yīng)用價值。

益智為姜科植物益智Alpinia oxyphylla Miq.的干燥成熟果實，主要產(chǎn)于我國的海南和廣東，為四大南藥之一。其功效為溫脾止瀉、攝唾涎、暖腎、固精縮尿，主治脾寒泄瀉、腹中冷痛、口多涎唾、腎虛遺尿、小便頻數(shù)、遺精白濁［2］，而且也是重要的調(diào)節(jié)生精功能的組方藥。本實驗研究益智仁提取物對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的生精障礙小鼠的治療作用，為益智仁提取物防治生殖障礙的應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及藥品

SPF級健康Balb/c雄性小鼠50只，體重(20±2)g［吉林大學(xué)實驗動物中心，合格證號SCXK-(吉)2008-4005］。環(huán)境溫度(22±2)℃。

益智仁(購自吉林大藥房);注射用環(huán)磷酰胺(批號11061921，購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司);其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 益智仁提取液的制備

稱取益智仁200 g，研磨成粉，放在燒杯里用蒸餾水浸泡30 min，然后按益智仁∶蒸餾水=1∶8煮沸30 min，用紗布過濾出液體到燒杯中。再按比例益智仁∶蒸餾水=1∶4煮沸30 min，得到第二次過濾出的液體，把兩次得到的液體混合，最后把其蒸發(fā)濃縮到200 mL，配制成濃度分別為0.8 g/kg、0.4 g/kg、0.2g/kg的混懸液，供灌胃使用。

1.3 生精障礙模型的制備與分組

將實驗用Balb/c小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)后，隨即分為5組即對照組、模型組、益智仁提取液高劑量組、益智仁提取液中劑量組、益智仁提取液低劑量組，每組10只。除對照組外，其余各組小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺75 mg/(kg·d)，連續(xù)5 d，制備生精障礙模型。模型制備后，益智仁提取液高劑量組、中劑量組、低劑量組分別給予益智仁提取液0.8 g/kg、0.4 g/kg、0.2 g/kg灌胃，對照組和模型組給予等體積生理鹽水，每天1次，共計30 d。

1.4 精子密度、活率及畸形率測定

將盛有10 mL精子營養(yǎng)液［3］的試管置于恒溫水浴箱中預(yù)熱至37℃，取單側(cè)附睪去除結(jié)締組織和脂肪，眼科剪剪碎組織并放入試管中，37℃靜止10 min，待精子充分游離后，取1滴滴于血細胞計數(shù)板上，計算精子密度(D)、精子活率(A)、精子畸形率(T)。

1.5 睪丸組織形態(tài)學(xué)檢測

取大鼠睪丸石蠟切片，HE染色，光鏡觀察睪丸組織內(nèi)精原細胞與各級生精細胞的分布情況。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS15.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以±S表示，組間比較采用one-way ANOVA分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 益智仁提取液對精子密度、活率及畸形率的影響

模型組小鼠精子密度、精子活率顯著低于對照組(P＜0.01)，精子畸形率顯著高于對照組(P＜0.01)。益智仁提取液各劑量組與模型組相比均顯著提高精子密度(P＜0.01)。益智仁提取液低劑量組與模型組相比，精子活率有提高(P＜0.05)。益智仁提取液中、高劑量組與模型組相比，精子活率顯著提高(P＜0.01)。益智仁提取液低劑量組與模型組相比精子畸形率降低(P＜0.05)，益智仁提取液中、高劑量組與模型組相比精子畸形率顯著降低(P＜0.01)。結(jié)果見表1。

表1 益智仁提取液對精子密度、活率及畸形率的影響(±S，n=10)

表1 益智仁提取液對精子密度、活率及畸形率的影響(±S，n=10)

與模型組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組 別 精子密度(106/mL)精子活率(%)精子畸形率(%)對照組 78+16＊＊ 84+5＊＊ 4.3+1.2＊＊模型組 26+5 32+7 13.4+1.2低劑量組 39+5＊＊ 38+12* 10.6+2.3*中劑量組 48+10＊＊ 54+9＊＊ 7.7+1.5＊＊高劑量組 56+14＊＊ 66+16＊＊ 5.2+2.4＊＊

2.2 益智仁提取液對小鼠睪丸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn):造模后，模型組與對照組相比，小鼠睪丸生精上皮細胞萎縮、退化，上皮層數(shù)變少，生精管腔中精子數(shù)目明顯減少。治療后，益智仁提取液各劑量組生精上皮數(shù)目均明顯增多，上皮層數(shù)也明顯增加，其中中劑量組與高劑量組對生精上皮改善更為明顯，基本恢復(fù)到正常組織結(jié)構(gòu)。結(jié)果見圖1。

圖1 益智仁提取液對生殖損傷小鼠睪丸組織形態(tài)學(xué)影響(HE×200)

3 討論

環(huán)磷酰胺是一種烷化劑類藥物，是常用的抗腫瘤藥物和免疫抑制劑，對男性生殖系統(tǒng)的損傷和對后代的潛在致畸危險已經(jīng)引起醫(yī)患雙方的高度關(guān)注。臨床研究顯示，兒童期因白血病、腫瘤、自身免疫性疾病接受環(huán)磷酰胺治療的男性患兒，成年后80.2%～92.6%為無精癥或少精癥［4-6］，目前已廣泛采用環(huán)磷酰胺制備生精障礙模型。

益智仁是治療弱精癥、少精癥的傳統(tǒng)組方藥，研究表明益智仁富含鋅、硒、錳等多種微量元素及維生素E、C等，可改善睪丸生精功能及精子運動功能［7］。目前有關(guān)其生殖治療和保護方面缺乏系統(tǒng)的研究。本研究通過水提法，研究益智仁水提物對環(huán)磷酰胺所致生精障礙小鼠的治療作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn):益智仁提取液各劑量組顯著提高精子密度。與模型組相比，益智仁提取液低劑量組精子活率有提高。益智仁提取液中、高劑量組與模型組相比，精子活率顯著提高。益智仁提取液低劑量組與模型組相比精子畸形率降低，益智仁提取液中、高劑量組與模型組相比精子畸形率顯著降低。形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示:益智仁提取液能夠改善生精上皮，促進其上皮再生，增加上皮層數(shù)，尤其益智仁提取液中、高劑量組生精上皮結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)到原來狀態(tài)，證實益智仁提取液具有良好的生精障礙治療作用。本研究為益智仁在生精障礙方面的應(yīng)用，提供了有益的參考，有關(guān)益智仁提取物改善和促進生精功能的機制問題，需要進一步的研究。

［1］ European Association of Urology.Urological Guidelines［R］.Guidelines on Male Infertility，2004.

［2］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:一部［S］.2005年版.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:204.

［3］ 范榮軍，任 濤，劉成柏，等.五味子多糖提取工藝的比較研究［J］.中成藥，2008，30(6):827-831.

［4］ van den Berg H，F(xiàn)urstner F，van den Bos C，et al.Decreasing the number of MOPP courses reduces gonadal damage in survivors of childhood Hodgkin disease［J］.Pediatr Blood Cancer，2004，42(3):210-215.

［5］ Kenney L B，Laufer M R，Grant F D，et al.High risk of infertility and long term gonadal damage in males treated with high dose cyclophosphamide for sarcoma during childhood［J］.Cancer，2001，91(3):613-621.

［6］ Gatta G，Capocaccia R，Coleman M P，et al.Childhood cancer survival in Europe and the United States［J］.Cancer，2002，95(8):1767-1772.

［7］ 王本祥.現(xiàn)代中藥藥理學(xué)［M］.天津:天津科學(xué)技術(shù)出版社，1999.