金銀花和野菊花乙醇提取物抑菌作用比較

楊海霞 張孝俠 程曉平 翟景花 方召陽

（濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，濟(jì)寧 山東272067）

金銀花，為忍冬科植物忍冬的干燥花蕾，具有清熱解毒、涼風(fēng)散熱的功效，其主要有效成分為綠原酸，有抗菌消炎的作用［1］。野菊花系菊科植物野菊、北野菊或巖香菊的干燥頭狀花序［2］，具有清熱解毒、疏風(fēng)平肝之功效，在我國民間藥用歷史悠久，中國藥典（2005年版）收載其栓劑用于抗菌消炎［3］。近年來，國內(nèi)外學(xué)者運(yùn)用現(xiàn)代理論知識做了大量的臨床藥理工作，從中醫(yī)科學(xué)的角度證實(shí)了金銀花、野菊花具有廣譜抗菌的藥理作用，本實(shí)驗(yàn)通過對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌的體外抑菌試驗(yàn)的研究，了解金銀花、野菊花的抗菌效果，并對其進(jìn)行比較，從而為臨床合理用藥提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 金銀花葉采于濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院盆景園；野菊花采于濟(jì)寧市動(dòng)植物園。

1.1.2 菌株 金黃色葡萄球菌（ATCC6538）、大腸桿菌（ATCC8099）、枯草桿菌（ATCC9372）標(biāo)菌株由濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室凍存。

1.1.3 試劑 牛肉浸膏、蛋白胨、氯化鈉、營養(yǎng)瓊脂粉、蒸餾水、生理鹽水、無水乙醇

1.1.4 儀器 數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠 型號HPX－9272MBE）；電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；立式電熱壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠 型號LDZX－30FB）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠型號RE－52AA）；恒溫水浴鍋

1.2 方法

1.2.1 金銀花乙醇提取物的制備 將采集的金銀花用蒸餾水沖洗干凈，然后放到干燥箱中烘干、粉碎。取9.7g金銀花用無水乙醇浸泡過夜，用恒溫水浴鍋加熱回流，倒出濾液后，殘?jiān)^續(xù)用無水乙醇浸泡過夜，重復(fù)操作兩次。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將濾出的液體濃縮至生藥含量為492mg／ml。

1.2.2 野菊花乙醇提取物的制備 將采集的野菊花用蒸餾水沖洗干凈，然后放到干燥箱中烘干、粉碎。取50g野菊花用無水乙醇浸泡過夜，用恒溫水浴鍋加熱回流，倒出濾液后，殘?jiān)^續(xù)用無水乙醇浸泡過夜，重復(fù)操作兩次。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將濾出的液體濃縮至生藥含量為1035mg／ml。

1.2.3 培養(yǎng)基的制備 取營養(yǎng)瓊脂粉9g于三角燒瓶中，加蒸餾水200ml，用酒精燈加熱使其全部溶解，經(jīng)121℃高壓滅菌20min，然后分裝到無菌平皿和試管中，制成平板培養(yǎng)基和斜面培養(yǎng)基，冷卻后4℃冷藏備用。

1.2.4 配制營養(yǎng)肉湯 取蛋白胨2.002g、牛肉浸膏1.005g、氯化鈉1.003g于三角燒瓶中，加100ml的蒸餾水，搖晃使其全部溶解，用2mol／L的Naoh調(diào)pH至7.2，經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌30min，冷卻后4℃冷藏備用。

1.2.5 3種細(xì)菌繁殖體懸液的制備［4］分別取金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌冷凍菌株管，室溫使其融化分散。取含5.0～10.0ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基試管，滴入少許菌種懸液，置37℃培養(yǎng)18～24h，分別用接種環(huán)取第1代培養(yǎng)的菌懸液，劃線接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，于37℃培養(yǎng)18～24h，挑取第2代培養(yǎng)物中的典型菌落，接種于營養(yǎng)瓊脂斜面，于37℃培養(yǎng)18～24h，即為第3代培養(yǎng)物。然后用5ml的稀釋液將第3代營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面新鮮菌苔洗下，制備成初步的菌懸液，再進(jìn)行系列稀釋，制成含菌量為5×105～5×106cfu／ml的實(shí)驗(yàn)菌懸液。

1.2.6 濾紙片的制備 將定性濾紙用打孔器制成6mm直徑的圓片，經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌20min后，干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 抑菌環(huán)的測定 在無菌營養(yǎng)瓊脂平板表面分別均勻涂抹3種實(shí)驗(yàn)菌懸液并置室溫干燥5min，然后在每個(gè)平板表面周邊距中心25mm等距離貼4片4層濾紙片，中心貼1片4層濾紙片，其中周邊4片加20μl金銀花乙醇提取物，中間1片加20μl無水乙醇作為陰性對照，然后將其置于37℃溫箱培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測量抑菌環(huán)的直徑（包括貼片）并記錄測量數(shù)據(jù)。重復(fù)試驗(yàn)4次。用同樣的方法做野菊花乙醇提取物抑菌環(huán)的測定。

判定標(biāo)準(zhǔn)：以抑菌環(huán)直徑大于8mm者判為有抑菌作用，抑菌環(huán)小于或等于8mm者判為無抑菌作用，4次重復(fù)試驗(yàn)均達(dá)到有抑菌作用者，判為合格。陰性對照組應(yīng)無抑菌環(huán)產(chǎn)生，否則實(shí)驗(yàn)無效。

1.2.8 金銀花與野菊花乙醇提取物對3種細(xì)菌的最低抑菌濃度測定 將金銀花乙醇提取物倍比稀釋成1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256 8個(gè)濃度各2.5ml，并設(shè)不含藥物的雙倍營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基作陽性對照。然后向各管中分別加入配好的菌懸液（金黃色葡萄球菌）100μl，混勻后放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48h后確定是否有細(xì)菌生長。大腸桿菌、枯草桿菌的最低抑菌濃度測定方法同金黃色葡萄球菌。以藥物抑制細(xì)菌生長的最低濃度為最小抑菌濃度（MIC）。

野菊花乙醇提取物對3種細(xì)菌的最低抑菌濃度測定方法同上。

2 結(jié)果

2.1 金銀花乙醇提取物抑菌試驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，生藥含量為492mg／ml的金銀花乙醇提取物，在營養(yǎng)瓊脂平板上對金黃色葡萄球菌、枯草桿菌的抑菌環(huán)直徑均大于8mm，顯示出良好的抑菌效果，而對大腸桿菌的抑菌環(huán)直徑小于8mm，說明對其無抑菌作用。見表1。

表1 金銀花乙醇提取物抑菌環(huán)試驗(yàn)結(jié)果

2.2 野菊花乙醇提取物抑菌試驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，生藥含量為1035mg／ml野菊花乙醇提取物，在營養(yǎng)瓊脂平板上對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑菌環(huán)直徑均大于8mm，顯示出良好的抑菌效果，而對枯草桿菌的抑菌環(huán)直徑小于8mm，說明對其無抑菌作用。見表2。

表2 野菊花乙醇提取物抑菌環(huán)試驗(yàn)結(jié)果

2.3 金銀花與野菊花乙醇提取物對三種細(xì)菌的最低抑菌濃度測定

見表3、表4。

表3 金銀花乙醇提取物不同稀釋度抑菌效果測定

表4 野菊花乙醇提取物不同稀釋度抑菌效果測定

由表3可見金銀花乙醇提取物對金黃色葡萄球菌和枯草桿菌抑菌作用較強(qiáng)，兩種菌的最低抑菌濃度皆為30.75mg／ml，對大腸桿菌的最低抑菌濃度為123mg／ml。

由表4可見野菊花乙醇提取物對大腸桿菌抑菌作用最強(qiáng)，最低抑菌濃度為16.17mg／ml；對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為對枯草桿菌的最低抑菌濃度為64.69mg／ml；對枯草桿菌的抑菌作用最弱，最低抑菌濃度為258.75mg／ml。

由表1、2、3、4可見，金銀花乙醇提取物對金黃色葡萄球菌和枯草桿菌作用最強(qiáng)，對大腸桿菌作用最弱；野菊花乙醇提取物對大腸桿菌作用最強(qiáng)，金黃色葡萄球菌次之，對枯草桿菌作用最弱。

3 討論

現(xiàn)代藥理研究表明，金銀花內(nèi)含有豐富的木草黃素、肌醇、皂苷、鞣酸等有效成分，因?yàn)樗鼈兒写罅康倪€原基因，所以對多種致病菌有抑制作用。由表1的抑菌環(huán)試驗(yàn)的測定結(jié)果可見，金銀花乙醇提取物對革蘭陽性菌（金黃色葡萄球菌、枯草桿菌）有明顯的抑菌作用，而對革蘭陰性菌（大腸桿菌）則沒有抑菌作用。管仲瑩等［5］人研究發(fā)現(xiàn)金銀花提取物具有一定的抑菌作用，與本試驗(yàn)中的抑菌范圍較接近，這可能與金銀花提取物的工藝及質(zhì)量、產(chǎn)地有關(guān)。

革蘭陽性菌與革蘭陰性菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)顯著不同，革蘭陽性菌細(xì)胞壁較厚，肽聚糖層可達(dá)50層，革蘭陰性菌細(xì)胞壁較薄，肽聚糖層僅有1～2層，使兩者在抗原性及藥物敏感性方面有很大的差異。本試驗(yàn)結(jié)果表明金銀花乙醇提取物具有很強(qiáng)的破壞細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖層的能力，進(jìn)一步說明了其抑制細(xì)菌生長的作用很強(qiáng)。

現(xiàn)代藥理研究表明，野菊花含有揮發(fā)油，具有廣譜的抗菌作用。現(xiàn)有研究認(rèn)為揮發(fā)油是菊花發(fā)揮抑菌作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，其中的樟腦、龍腦是其發(fā)揮抑菌作用的主要成分［6］。由表2的抑菌環(huán)試驗(yàn)的測定結(jié)果可見，野菊花乙醇提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌有明顯的抑菌作用，而對枯草桿菌則沒有抑菌作用。曾帥等［7］人研究發(fā)現(xiàn)野菊花水煎液對多種細(xì)菌均有較強(qiáng)的抑菌作用，與本試驗(yàn)中的抑菌范圍較接近，這可能與野菊花的提取方式不同有關(guān)。有報(bào)道顯示［8］，相同的中藥采用不同的提取方式，其提取物的抑菌活性會(huì)有顯著差別。

本次實(shí)驗(yàn)所用的是乙醇萃取劑，而乙醇本身的抑菌作用不能忽視，尤其是本次實(shí)驗(yàn)藥物稀釋前后抑菌環(huán)直徑不是成比例的縮小，在一定程度上體現(xiàn)出了乙醇是本次實(shí)驗(yàn)的一個(gè)重要影響因素。但乙醇易揮發(fā)，作用不穩(wěn)定，所以在一般的實(shí)驗(yàn)中很少涉及關(guān)于乙醇的空白實(shí)驗(yàn)。近年來中藥提取物對細(xì)菌的抑制作用研究較多，而中藥抑菌作用的研究也是開發(fā)利用中藥資源的一個(gè)重要組成部分。本實(shí)驗(yàn)只是對金銀花和野菊花進(jìn)行了粗提，因此，不能確定到底是哪種具體成分具有抑菌作用。下一階段的研究任務(wù)是采用不同的分離方法分離金銀花和野菊花的具體成分，以便確定到底是哪種成分具有抑菌作用。

［1］ 任愛農(nóng)，王志剛，盧振初，等.金銀花抑菌和抗病毒作用實(shí)驗(yàn)研究［J］.藥物生物技術(shù)，1999，6（4）：241.

［2］ 南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典［M］.2版.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2006：2144.

［3］ 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典2005年版［M］.一部.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：596.

［4］ 消毒產(chǎn)品檢驗(yàn)消毒技術(shù)規(guī)范［S］.北京：中華人民共和國衛(wèi)生部，2002：83－93.

［5］ 管仲瑩，趙金明，林巧智.金銀花提取物抑菌作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.遼寧省中醫(yī)藥研究院，2009，47（15）：150－152.

［6］ 張清華，張玲.菊花化學(xué)成分及藥理作用的研究進(jìn)展［J］.食品與藥品，2007，2：60－63.

［7］ 曾帥，王子壽，賈俊.野菊花水煎液體外抗菌作用實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國中醫(yī)急癥，2008，7（17）：971.

［8］ 高靜，龍偉.中藥提取技術(shù)的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)導(dǎo)報(bào).2007，26（9）：1058－1060.