降鈣素基因相關(guān)肽經(jīng)鼻靶向中樞給藥的實(shí)驗(yàn)研究＊

孫樹(shù)印 吳慶建 閆承軍 焦 華

（濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院，山東 濟(jì)寧272011）

降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene－related peptide，CGRP）是目前體內(nèi)已知的最強(qiáng)的舒血管活性肽，分為α型和β型，由37個(gè)氨基酸殘基組成，廣泛分布于神經(jīng)及心血管系統(tǒng)，參與機(jī)體許多功能的調(diào)節(jié)，與多種疾病有著密切關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)腦血管的發(fā)生和防治中有重要意義，如腦梗死、蛛網(wǎng)膜下腔出血等有著潛在的治療作用。CGRP的分子量為3786.91KDa，其大分子特性使其經(jīng)靜脈給藥無(wú)法透過(guò)血腦屏障到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)起到治療作用。迄今為止臨床缺乏一種合理有效的靶向中樞的給藥途徑。近年來(lái)很多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)鼻給藥是一種新的中樞神經(jīng)系統(tǒng)給藥途徑，我們?cè)O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，將CGRP經(jīng)鼻靶向中樞給藥，采用酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）測(cè)定大鼠腦內(nèi)各分區(qū)CGRP的濃度，研究CGRP經(jīng)鼻靶向中樞給藥的可行性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動(dòng)物模型及分組 健康成年Sprague－Dawley大鼠，雄性，體重230～270g，共24只，提供單位（山東魯抗實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），將動(dòng)物置于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，室溫（23±1）℃，自由飲水進(jìn)食。制作大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞（Middle cerebral artery occlusion，MCAO）缺血模型，造模成功后，將模型隨機(jī)分為對(duì)照組（不予任何干預(yù)）、靜脈注射CGRP組（IV CGRP組）50μg／0.5ml、經(jīng)鼻給予媒介液組、經(jīng)鼻給予CGRP（IN CGRP組）50μg／50μl，每組各6只MCAO大鼠，采用ELISA測(cè)定大鼠腦各分區(qū)中的CGRP濃度。

1.1.2 主要試劑和儀器 CGRP購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司，CGRP濃度檢測(cè)采用武漢中美科技有限公司ELISA試劑盒；美國(guó)Bio－Rad酶標(biāo)；4－0單股尼龍線(xiàn)購(gòu)自強(qiáng)生公司。JA－31001型電子分析天平（上海天平儀器廠(chǎng)），微量注射器（無(wú)錫東風(fēng)玻璃儀器廠(chǎng)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MCAO模型 參照Z(yǔ)ea等［1］的MCAO栓線(xiàn)模型制作方法，部分加以改良。麻醉方法采取10%水合氯醛（350mg／kg）腹腔注射，取頸前正中切口，依次暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈。在右頸總動(dòng)脈與右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈起始部，插入1根4－0尼龍線(xiàn)（頂端用火燒圓的，避免刺破動(dòng)脈，造成蛛網(wǎng)膜下腔出血），即可閉塞大腦中動(dòng)脈，插入深度為18mm左右。

1.2.2 給藥方法 1）經(jīng)鼻給藥（IN給藥）：大鼠處于麻醉狀態(tài)，固定四肢，取仰臥位，并將頭頸背稍稍墊高，以利于藥物進(jìn)入后鼻腔。兩側(cè)鼻孔交替給藥，經(jīng)鼻給予50μl CGRP或媒介液，間隔時(shí)間為5min，單次給藥劑量為10μl，共需25min左右。2）經(jīng)靜脈給藥：經(jīng)大鼠尾靜脈注射0.5ml CGRP或媒介液。

1.2.3 ELISA檢測(cè) 給藥結(jié)束后30min，過(guò)量麻醉處死大鼠后，取完腦脊液后，斷頭取腦，分別取嗅球、皮質(zhì)、海馬、橋腦、頸髓，電子天平稱(chēng)重，置于－85℃低溫冰箱中備用。按w：v（g：ml）＝1∶20的比例加入勻漿液進(jìn)行組織勻漿，將勻漿液15 000 r／min離心30min，完畢后取上清液。ELISA測(cè)定方法嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用±s表示，組間比較采用單因素方差分析（兩兩比較比較采用LSD法），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

IV和IN給予CGRP后在大鼠腦部各分區(qū)的濃度變化。由表1可知，IV給藥組腦部CGRP濃度最高處為嗅球處（836.3pg／g），其次為腦脊液（810.5pg／g）。IN給藥組CGRP濃度最高的部位為嗅球（3536.3pg／g），其次為腦脊液（2895.6pg／g）。對(duì)4組大鼠腦部CGRP進(jìn)行方差分析發(fā)現(xiàn)，IN CGRP組中CGRP在大腦腦部各分區(qū)的濃度均明顯高于其他各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；對(duì)照組、IV CGRP組和IN NS組CGRP在各腦部分區(qū)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 不同途徑給予CGRP后各腦區(qū)CGRP濃度變化（±s，pg／g）

表1 不同途徑給予CGRP后各腦區(qū)CGRP濃度變化（±s，pg／g）

a：表示與對(duì)照組比較，P＜0.05；b：表示與CGRP組比較，P＜0.05；c：表示與IN NS組比較，P＜0.05。

分組 嗅球 皮質(zhì) 海馬 橋腦 頸髓 腦脊液對(duì)照組 537.9±64.5 463.4±50.9 500.5±36.9 495.3±42.9 469.3±36.9 525.6±46.8 IV CGRP組836.3±126.4 657.8±126.7 689.6±89.7 756.6±96.9 698.6±115.8 810.5±110.9 IN NS組 495.6±64.5 457.6±62.9 510.3±45.8 479.6±42.9 482.3±40.9 530.4±53.3 IN CGRP組3536.3±637.5abc 2108.4±365.9abc 2600.4±425.9abc 1897.5±300.7abc 2346.7±369.8abc 2895.6±425.7abc F值 119.494 97.305 129.575 104.811 128.155 158.3 31 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

CGRP是一種與降鈣素基因同源的生物活性多肽，1983年Rosenfeld等采用用DNA基因重組和分子生物技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，組成結(jié)構(gòu)為2800個(gè)堿基對(duì)，分子量3786.91。人和鼠的CGRP具有相近似的生物活性，含α和β兩種基因，分別表達(dá)兩種分子異構(gòu)肽，分別由11號(hào)染色體上兩個(gè)相互獨(dú)立的基因編碼［2］，在第3、22、25位氨基酸組成有所不同。CGRP是目前研究發(fā)現(xiàn)效果最強(qiáng)的舒血管活性肽，作為神經(jīng)遞質(zhì)廣泛存在于中樞和周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)內(nèi)，特別是感覺(jué)神經(jīng)元的胞體和末梢內(nèi)［3］。CGRP可能是神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)損傷反應(yīng)的一種重要的保護(hù)性因素，當(dāng)缺氧、缺血等因素引起神經(jīng)元損傷時(shí)，CGRP在神經(jīng)元的分布和表達(dá)的量發(fā)生改變。Wang S等［4］研究提示CGRP可能通過(guò)上調(diào)Bcl－2的表達(dá)對(duì)減輕腦缺血—再灌注腦組織的損傷有顯著作用。張璐等［5］制作大鼠全腦缺血再灌注模型，經(jīng)頸動(dòng)脈直接注入CGRP，采用腦組織切片染色的方法觀(guān)察CGRP對(duì)腦組織神經(jīng)細(xì)胞缺血性損傷的影響，研究發(fā)現(xiàn)CGRP對(duì)缺血后海馬CA1的錐體細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。由于血腦屏障的阻隔，加之CGRP大分子特性，外周給藥時(shí)很難通過(guò)血腦屏障到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)。直接注射到側(cè)腦室及大腦實(shí)質(zhì)，由于手術(shù)具有創(chuàng)傷性、術(shù)后并發(fā)癥以及費(fèi)用偏高等多種原因，臨床不能廣泛應(yīng)用。因此，外源性的CGRP如何能有效地遞送至中樞神經(jīng)系統(tǒng)，目前尚處于探索階段。

經(jīng)鼻給藥作為新發(fā)現(xiàn)的靶向中樞神經(jīng)系統(tǒng)給藥途徑，已引起神經(jīng)病學(xué)研究領(lǐng)域眾多學(xué)者的關(guān)注。鼻是呼吸器官又是嗅覺(jué)器官，根據(jù)功能及組織結(jié)構(gòu)的不同可分為3個(gè)區(qū)域：鼻前庭、嗅區(qū)和呼吸區(qū)。鼻前庭幾乎無(wú)吸收功能，呼吸區(qū)黏膜富含毛細(xì)血管，血流豐富，藥物由此吸收進(jìn)入體循環(huán)；嗅區(qū)位于上鼻甲，面積約10cm2，緊貼篩板之下，藥物可由此吸收進(jìn)入腦脊液，從而進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。當(dāng)IN給藥后，藥物通過(guò)嗅區(qū)吸收，則可以避開(kāi)BBB阻礙，進(jìn)而廣泛分布于CNS內(nèi)。雖然眾多的實(shí)驗(yàn)研究［6－9］結(jié)果表明，蛋白多肽類(lèi)藥物經(jīng)鼻靶向給藥可以到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，但經(jīng)鼻靶向中樞給藥的具體機(jī)制仍然不是很清楚，目前認(rèn)為可能存在兩種途徑：1）嗅神經(jīng)通路［10－11］；2）細(xì)胞外途徑［12－13］。本實(shí)驗(yàn)采取ELISA檢測(cè)大鼠腦組織中CGRP濃度，操作方法簡(jiǎn)單方便，具有很高的靈敏度及特異性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IN靶向中樞給予CGRP后，于靜脈給藥組和對(duì)照組相比，腦各分區(qū)的濃CGRP度顯著升高，證實(shí)了IN靶向中樞給予CGRP的途徑可避開(kāi)血腦屏障的阻礙，且優(yōu)于IV途徑。

經(jīng)鼻靶向中樞遞送CGRP的方法具有中樞靶向性強(qiáng)、方便、無(wú)創(chuàng)傷性的特點(diǎn)，藥物可以迅速到達(dá)CNS，起到治療作用的同時(shí)避免了全身用藥可能帶來(lái)的副作用。因此，經(jīng)鼻靶向中樞遞送CGRP的方法可能為一條有效的治療腦缺血損傷或其他CNS疾病的新途徑，至于CGRP經(jīng)鼻給藥避開(kāi)血腦屏障直接進(jìn)入CNS的確切轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制尚有待進(jìn)一步闡明。

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