SNRPN基因rs220030位點(diǎn)的分型及甲基化親緣相關(guān)性

李 輝 ，徐紅梅 ，趙 赟 ，李備栩 ，周懷谷 ，趙子琴

（1.復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，上海 200032；2.法醫(yī)物證學(xué)現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用技術(shù)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市現(xiàn)場(chǎng)物證重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200083）

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）在人類基因組中的總數(shù)超過300萬[1]，且遺傳穩(wěn)定性更高，在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域可作為STR基因座的有力補(bǔ)充手段。印記基因是指親緣依賴性單等位基因表達(dá)，即只有一個(gè)父源性或母源性等位基因表達(dá)，印記基因的表達(dá)不符合經(jīng)典的孟德爾遺傳定律，其表達(dá)與否取決于其親代來源。DNA甲基化是基因印記的重要標(biāo)志，DNA甲基化差異的區(qū)域被稱為差異甲基化區(qū)域（differentially methylated region，DMR）。 Huang等[2]應(yīng)用PIA法檢測(cè)H19基因上游片段4個(gè)SNP位點(diǎn)，成功對(duì)父源和母源印記基因進(jìn)行了判定，表明等位基因親緣差異性DNA甲基化聯(lián)合毗鄰的SNP位點(diǎn)多態(tài)性在法醫(yī)親權(quán)鑒定中有良好的應(yīng)用前景[3]。

rs220030位點(diǎn)位于小核核糖核蛋白多肽N基因（small nuclear ribonucleoprotein polypeptide N，SNRPN）上游啟動(dòng)子區(qū)域，rs220030位點(diǎn)上游存在若干CpG，其鄰近的rs220028已被證實(shí)可用于親緣等位基因判定[4]。本研究先運(yùn)用DGGE技術(shù)對(duì)97例上海地區(qū)漢族家系血樣的rs220030位點(diǎn)進(jìn)行定性分型，同時(shí)運(yùn)用焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)其中的25例血液來源的家系樣本的rs220030位點(diǎn)進(jìn)行定量分型并加以比較，結(jié)合重亞硫酸鹽修飾方法通過焦磷酸測(cè)序分析三聯(lián)體家系樣本rs220030位點(diǎn)上游CpG甲基化狀態(tài)的關(guān)聯(lián)性，判斷rs220030是否可用于親緣等位基因的判定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

9700型PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)AB公司），DCode通用突變檢測(cè)系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司），紫外凝膠成像儀（上海復(fù)日科技有限公司），PyroMark Q96 ID焦磷酸測(cè)序儀、QIAamp DNA Micro試劑盒、EpiTect Bisulfite試劑盒（德國(guó)QIAGEN公司），PCR擴(kuò)增試劑盒（上海天根生化科技有限公司）。

1.2 樣本及DNA提取

收集97例上海地區(qū)漢族人群家系血樣（25例血液樣本由瑞金醫(yī)院提供，72例血痕樣本由司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所提供），其中有29個(gè)三聯(lián)體家系樣本和2個(gè)五代家系樣本。運(yùn)用QIAamp DNA Micro試劑盒提取DNA。

1.3 引物合成

根據(jù)GenBank序列資料提供的rs220030位點(diǎn)正反向序列信息，應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)DGGE測(cè)序引物，由上海生工生物技術(shù)公司合成（表 1）。 應(yīng)用 PyroMark Assay Design Software 2.0軟件設(shè)計(jì)4對(duì)焦磷酸測(cè)序引物（1對(duì)用于SNP分型，3對(duì)用于檢測(cè)rs220030上下游CpG甲基化狀態(tài)），由上海英駿生物技術(shù)公司合成（表2）。

1.4 PCR擴(kuò)增

DGGE的PCR反應(yīng)體系為10μL：DNA模板4μL，正反向引物各0.5μL，PCR反應(yīng)混合液5μL。擴(kuò)增條件：95℃ 5min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 60s，35 個(gè)循環(huán)；95℃ 5min。

焦磷酸的 PCR 反應(yīng)體系為 50 μL：H2O 34.8 μL，緩沖液 10μL，dNTP 1μL，P1 1μL，P2 1μL，DNA 模板 2 μL，Taq 酶 0.2 μL。 擴(kuò)增條件：95℃ 5 min；95℃30s，53℃ 30s，72℃ 60s，38 個(gè)循環(huán)；72℃ 7min。

1.5 DGGE技術(shù)SNP分型

采用DGGE技術(shù)對(duì)97例家系樣本rs220030位點(diǎn)進(jìn)行分型，變性梯度凝膠由10%聚丙烯酰胺［V（丙烯酰胺）∶V（雙丙烯酰胺）=37.5∶1］配制而成，變性劑含量梯度范圍35%～65%，100%變性劑包含7 mol/L尿素、40%去離子甲酰胺，1×TBE作為電泳緩沖液加熱到60℃，10μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與2μL 6×溴酚藍(lán)二甲苯青上樣緩沖液混勻后點(diǎn)樣，電泳電壓170V，電泳時(shí)間210min。電泳結(jié)束后，凝膠經(jīng)EB染色30min后，用紫外凝膠成像儀觀察結(jié)果。

1.6 焦磷酸測(cè)序技術(shù)SNP分型

采用焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)25例血液來源的家系樣本rs220030位點(diǎn)進(jìn)行分型，根據(jù)PyroMark AQ模式設(shè)計(jì)好程序并在試劑倉(cāng)內(nèi)加好程序給定劑量的反應(yīng)酶底物和dNTP等試劑，并通過PyroMark AQ-SNP模式讀取分析結(jié)果。

1.7 重亞硫酸鹽修飾

隨機(jī)選擇2組血液來源的家系樣本用EpiTect Bisulfite試劑盒進(jìn)行重亞硫酸鹽修飾。反應(yīng)體系為140 μL（85 μL 亞硫酸鹽混合液，35 μL DNA 保護(hù)緩沖液，20μL DNA模板），根據(jù)試劑盒說明書完成操作。

1.8 修飾后樣本PCR擴(kuò)增

擴(kuò)增反應(yīng)體系 50μL：H2O 34.8μL，緩沖液 10μL，dNTP 1μL，P1 1μL，P2 1μL，DNA 模板 2μL，Taq酶0.2μL。第一個(gè)CpG所在序列的反應(yīng)條件：95℃ 5min；95℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 60s，38 個(gè)循環(huán)；72℃ 7min。第二、三個(gè)CpG所在序列的反應(yīng)條件：95℃ 5 min；95℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 60s，38 個(gè)循環(huán)；72℃ 7min。

1.9 甲基化狀態(tài)的焦磷酸測(cè)序分析

重亞硫酸鹽修飾后樣本經(jīng)PCR擴(kuò)增后上機(jī)檢測(cè)，根據(jù)PyroMark CpG軟件設(shè)計(jì)好程序，在試劑倉(cāng)內(nèi)加好程序給定劑量的所需反應(yīng)酶底物和dNTP等試劑，并通過PyroMark CpG軟件讀取分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 DGGE電泳結(jié)果

97例家系樣本經(jīng)DGGE技術(shù)檢測(cè)，在電泳圖譜中顯示1條或4條清晰電泳譜帶，1條譜帶為純合子（根據(jù)分子量大小，靠下的為C純合子，靠上的為T純合子），4條譜帶為雜合子（2條為同源雙鏈，2條為異源雙鏈），部分樣本結(jié)果見圖1。97例家系樣本基因分型結(jié)果為：C純合子20例、T純合子29例以及C/T雜合子48例。

圖1 rs220030位點(diǎn)分型的DGGE電泳圖譜

2.2 焦磷酸測(cè)序SNP分型結(jié)果

25例血液來源的家系樣本經(jīng)焦磷酸測(cè)序SNP分型，分型結(jié)果與DGGE分型結(jié)果一致，部分樣本結(jié)果見圖2。

2.3 焦磷酸測(cè)序分析rs220030位點(diǎn)上游CpG甲基化狀態(tài)結(jié)果

2組家系樣本（家系1、家系2）經(jīng)過重亞硫酸鹽修飾后，經(jīng)焦磷酸測(cè)序分析，rs220030上游CpG甲基化狀態(tài)結(jié)果見圖3、表3。

圖2 rs220030位點(diǎn)分型的焦磷酸測(cè)序SNP分型結(jié)果

圖3 家系1母親樣本rs220030上游CpG甲基化狀態(tài)

表3 家系樣本rs220030上游甲基化狀態(tài)（%）

3 討 論

3.1 rs220030位點(diǎn)的DGGE技術(shù)SNP分型

變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技術(shù)作為一種經(jīng)典的電泳SNP分型技術(shù)，對(duì)于小規(guī)模、低通量的SNP分型或者突變檢測(cè)中具有一定的實(shí)用性。DGGE是利用DNA片段雙螺旋解鏈溫度（Tm）的差異進(jìn)行突變分析。DNA片段在變性梯度凝膠中電泳時(shí)，起初雙螺旋DNA片段以恒定速率向前遷移，在抵達(dá)變性效果相當(dāng)于其Tm值的變性劑濃度點(diǎn)時(shí)，雙鏈DNA開始部分解鏈而呈分支狀使其遷移速度極度減緩，幾乎處于“停頓”狀態(tài)。長(zhǎng)度相同的DNA片段，即使僅存在單個(gè)堿基改變，也將影響鄰近堿基間的相互作用，導(dǎo)致Tm值改變，從而使DNA片段在相同電泳時(shí)間內(nèi)因不同位移而得以分離[5]。趙赟等[6]運(yùn)用DGGE技術(shù)與TaqMan探針技術(shù)對(duì)100例上海漢族人群rs220030位點(diǎn)進(jìn)行分型得出群體遺傳學(xué)數(shù)據(jù)，證明該SNP位點(diǎn)滿足法醫(yī)親權(quán)鑒定和個(gè)人識(shí)別的需要。本研究運(yùn)用DGGE技術(shù)對(duì)97例家系樣本進(jìn)行rs220030位點(diǎn)分型，檢測(cè)出1條電泳譜帶的為純合子（靠下的為C純合子，靠上的為T純合子），4條電泳譜帶的為雜合子（2條為同源雙鏈，2條為異源雙鏈）。同時(shí)本研究在引物的5′端加入一段40 bp的GC-clamp序列可立刻提高其對(duì)單堿基突變的檢測(cè)效率，與Sheffield等[7]得出相同結(jié)論。

3.2 焦磷酸測(cè)序技術(shù)SNP分型的優(yōu)勢(shì)

焦磷酸測(cè)序（pyrosequencing）是一種實(shí)用的短序列實(shí)時(shí)檢測(cè)技術(shù)，能夠準(zhǔn)確定量檢測(cè)出單個(gè)SNP位點(diǎn)的多態(tài)性[8]。在SNP分型上，DGGE技術(shù)存在操作過程繁瑣、通量低、一次僅能檢測(cè)十多個(gè)樣本、變性梯度凝膠配制難度大等問題，而焦磷酸測(cè)序技術(shù)一次測(cè)序只需設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增引物和一個(gè)測(cè)序引物即可，不需要制膠、毛細(xì)管、熒光染料和同位素，易于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化的操作流程進(jìn)行大樣本群體SNP分型，靈敏度高、準(zhǔn)確性高、精確性好。與傳統(tǒng)的直接測(cè)序法比較，焦磷酸測(cè)序技術(shù)可以讀出引物結(jié)合以后的臨近堿基，更有助于對(duì)小片段的精確定性，而傳統(tǒng)的直接測(cè)序法在引物結(jié)合位置后的20個(gè)堿基左右通常不可讀。本研究針對(duì)25例血液來源的家系樣本進(jìn)行焦磷酸測(cè)序，C純合子結(jié)果為 C：100%，T：0%；T純合子結(jié)果為 C：0%，T：100%；C/T雜合子結(jié)果為C和T百分比各占一半左右（C：58%，T：42%）。 結(jié)果與 DGGE 技術(shù)檢測(cè)結(jié)果一致，但相比DGGE技術(shù)，進(jìn)行焦磷酸測(cè)序操作過程簡(jiǎn)單直接，無需配制變性梯度凝膠，無需反復(fù)摸索電泳條件，并且在結(jié)果觀察上，相比觀察DGGE電泳譜帶可能出現(xiàn)偽帶的情況，焦磷酸測(cè)序結(jié)果更為直觀。

3.3 焦磷酸測(cè)序技術(shù)分析CpG甲基化狀態(tài)

應(yīng)用焦磷酸測(cè)序?qū)pG甲基化狀態(tài)進(jìn)行分析，結(jié)合重亞硫酸鹽修飾方法，用重亞硫酸鹽將未甲基化的胞嘧啶（C）修飾為尿嘧啶（U），甲基化的胞嘧啶保持不變，經(jīng)過PCR擴(kuò)增后，尿嘧啶（U）將變成胸腺嘧啶（T），由此單個(gè)CpG甲基化狀態(tài)的分析就轉(zhuǎn)化為普通SNP位點(diǎn)的C/T單堿基多態(tài)性分析，其中等位基因C的頻率即為基因甲基化的程度，能夠準(zhǔn)確定量分析出待測(cè)基因的CpG甲基化狀態(tài)[9]。本研究對(duì)經(jīng)過重亞硫酸鹽修飾的2組家系樣本進(jìn)行rs220030上游CpG甲基化狀態(tài)進(jìn)行分析，單個(gè)CpG等位基因C的頻率即為該CpG上胞嘧啶甲基化程度，如家系1母親樣本3個(gè)CpG的C等位基因頻率分別為66%、64%、55%，表示這3個(gè)CpG胞嘧啶的甲基化程度分別為66%、64%、55%。

3.4 rs220030位點(diǎn)上游CpG甲基化親緣相關(guān)性

通常親子鑒定中假設(shè)父不具備生父基因，即可排除親子關(guān)系，但在某些情況下如母親和孩子為相同基因型的雜合子時(shí)，則生父、生母基因無法確定。聯(lián)合分析毗鄰印記基因座的親緣特異性甲基化標(biāo)記和多態(tài)性遺傳標(biāo)記，可解決單親家系親代與子代為相同基因型的雜合子時(shí)，生父、生母基因無法確定的問題[10]。人類基因組中，CpG二核苷酸在基因啟動(dòng)子區(qū)和第一外顯子區(qū)域等一些特定區(qū)域常成簇出現(xiàn)，形成CpG富集現(xiàn)象，稱為CpG島（CpG island），以往對(duì)親緣差異性甲基化的研究主要集中在CpG島。rs220030位于SNRPN基因上游啟動(dòng)子區(qū)域，Nakayashiki等[11]研究發(fā)現(xiàn) 5 個(gè)印記基因（H19、HYMAI、MEST、SNPRN、PEG）內(nèi)有7個(gè)以上SNP可用于親緣等位基因判定，其中的rs220028與rs220030毗鄰，rs220030位點(diǎn)雖然不在CpG島上，但rs220030與rs220028之間有3個(gè)散在的CpG。本研究應(yīng)用焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)經(jīng)過重亞硫酸鹽修飾過的2組三聯(lián)體家系樣本rs220030上游CpG甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)，分析其親緣相關(guān)性，子代3個(gè)CpG的甲基化程度與母親3個(gè)CpG的甲基化程度接近（表3），表明子代3個(gè)CpG的甲基化來源于母親。從而說明了在啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)CpG島鄰近的散在CpG也可能存在甲基化親緣相關(guān)性，結(jié)合毗鄰的SNP位點(diǎn)，有用于親緣等位基因判定的可行性。

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