大豆蛋白過(guò)敏原結(jié)構(gòu)與功能的研究進(jìn)展

朱婷偉，陳復(fù)生，布冠好，孫 倩，劉昆侖

(河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南鄭州450001)

大豆是我國(guó)種植面積最廣、食用最多而又廉價(jià)的植物蛋白資源，在食品工業(yè)中廣泛使用［1］。但同時(shí)大豆是8類主要致敏食物之一。大豆蛋白是存在于大豆種子中許多蛋白質(zhì)的總稱，成分按沉降系數(shù)不同分為2S組分8%～22%、7S組分35%、11S組分31%～52%、15S組分5%及存在的少量其他成分。其中，7S組分中約85%是β－伴大豆球蛋白;11S組分中約85%是大豆球蛋白［2］。大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白是大豆中蛋白質(zhì)的主要構(gòu)成成分，二者約占到70%。大豆過(guò)敏可引發(fā)過(guò)敏體質(zhì)人群產(chǎn)生Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)，目前在線過(guò)敏原數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄有41條大豆過(guò)敏原信息［3］。多項(xiàng)研究證實(shí)，大豆蛋白過(guò)敏原會(huì)引起嬰幼兒、仔豬、犢牛、大鼠等幼齡動(dòng)物的過(guò)敏反應(yīng)［4］。約1%～6%的嬰幼兒對(duì)大豆過(guò)敏，隨著對(duì)大豆及大豆產(chǎn)品使用量的增加，成年人對(duì)大豆過(guò)敏的發(fā)生率也在日趨上升［5］。大豆過(guò)敏可引起胃腸道紊亂，皮炎性過(guò)敏，惡心、嘔吐，嚴(yán)重時(shí)還可導(dǎo)致休克和死亡［6］。近些年，有學(xué)者就主要過(guò)敏原的抗原表位，過(guò)敏原改性方法及檢測(cè)方法進(jìn)行了一定研究，但對(duì)大豆過(guò)敏原的抗原表位、結(jié)構(gòu)特性及過(guò)敏原的種類等研究還不夠完善。本文將對(duì)大豆蛋白主要過(guò)敏原的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)，為大豆蛋白過(guò)敏原結(jié)構(gòu)、抗原表位的完善及低敏性大豆蛋白制品的開(kāi)發(fā)提供重要的理論依據(jù)。

1 大豆蛋白過(guò)敏原的結(jié)構(gòu)與功能

大豆抗原是大豆中的主要抗?fàn)I養(yǎng)因子之一，是能引起過(guò)敏反應(yīng)的一類蛋白質(zhì)，亦稱大豆過(guò)敏原。Franck［7］研究發(fā)現(xiàn)，不同的大豆產(chǎn)品中蛋白質(zhì)含量和抗原分布不同。大豆中發(fā)現(xiàn)有致敏性的蛋白如表1所示。其中7S球蛋白組分中的Gly m Bd 28K和Gly m Bd 30K和β－伴大豆球蛋白的α亞基Gly m Bd 60K是大豆中的主要致敏原［8］。

1.1 Gly m Bd 30K

Gly m Bd 30K與P34的氨基酸組成和N端氨基酸序列一致，故又名P34。它是由257個(gè)氨基酸殘基組成的不溶于水的單分子糖蛋白，分子量約為34ku，等電點(diǎn)為5.79［15］。該蛋白能與β－伴大豆球蛋白的亞基通過(guò)二硫鍵結(jié)合來(lái)參與大豆蛋白的折疊。單曉紅［15］等對(duì)Gly m Bd 30K二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的結(jié)果顯示:α－螺旋占 29.29%，β－轉(zhuǎn)角占 5.28%，β－折疊占19.53%，無(wú)規(guī)則卷曲為45.91%。除部分α－螺旋和β－轉(zhuǎn)角在蛋白質(zhì)的外側(cè)，絕大部分β－折疊在蛋白質(zhì)的中間區(qū)域。P34與木瓜蛋白酶家族的三級(jí)構(gòu)象是一致的，屬于木瓜蛋白酶超家族。圖1為預(yù)測(cè)的P34的三級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖［15］。

30K主要存在于種子的子葉里，能與油體結(jié)合在一起。P34可能是植物對(duì)抗假單胞菌的一種防御蛋白，其生物學(xué)功能通過(guò)結(jié)合細(xì)菌分泌的丁香交酯而起防御的作用;有研究顯示P34的變種大豆還可作為調(diào)節(jié)丁香交酯分泌的信號(hào)感受器［16］。

1.2 Gly m Bd 60K

β－伴大豆球蛋白包含α亞基、α'亞基和β亞基三個(gè)亞基，分子質(zhì)量分別約為68、71和50ku，它們以同源或異源的三聚體形式存在［17］。其中Gly m Bd 60K是由多糖與蛋白質(zhì)N端的天門冬氨酸結(jié)合而成，等電點(diǎn)為4.9。袁德保［18］等利用遠(yuǎn)紫外圓二色光譜對(duì)純化得到的β－伴大豆球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征，其中α亞基的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α－螺旋占9.8%，β－折疊占32.1%，β－轉(zhuǎn)角占22.8%，無(wú)規(guī)則卷曲占35.4%。其模擬的三級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖如圖2所示［19］。

表1 大豆中抗原蛋白及其相關(guān)性質(zhì)［9］Table 1 Allergen proteins in soybean and their relative characteristics［9］

圖1 預(yù)測(cè)的P34三級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Predicted tertiary structure of P34

圖2 Gly m Bd 60K的三維結(jié)構(gòu)示意圖Fig.2 Three－dimensional structure of Gly m Bd 60K

60K具有較好的熱穩(wěn)定性［20］。左偉勇提到有人從α亞基中提取到的soymetide－4能夠刺激人的多核白細(xì)胞的吞噬作用，且在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中能夠抑制服用抗癌藥所引起的禿毛癥;更有研究表明伴大豆球蛋白能刺激肝臟中的低密度脂蛋白受體，降低膽固醇的含量［21］。

1.3 Gly m Bd 28K

Gly m Bd 28K是一種類蠶豆球蛋白，屬于Cupin超家族。它是大豆7S組分中的另一種重要的過(guò)敏原，包含了220個(gè)氨基酸殘基，分子質(zhì)量約為26ku，等電點(diǎn)為6.1［22］。28K的多糖分支鏈為β－1→2木糖和α－1→3巖藻糖，在植物體內(nèi)以寡聚體形式存在，推測(cè)的糖骨架為Man3GIcNAc［23］2，結(jié)構(gòu)為普通的β－桶形。28K的前體為C－末端的23ku肽，N266殘基的羧基側(cè)裂解發(fā)生28K與前體的轉(zhuǎn)換，且在28K中內(nèi)切酶可能與天冬氨酰肽鏈內(nèi)切酶功能類似，參與到植物蛋白的代謝過(guò)程中［24］。

2 大豆蛋白的過(guò)敏原表位

引起人過(guò)敏的過(guò)敏原大多數(shù)是食物中的蛋白質(zhì)，實(shí)質(zhì)上，與過(guò)敏反應(yīng)相關(guān)的是蛋白質(zhì)中部分抗原決定簇，又稱為表位［25］。Burks［26］的免疫印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大豆過(guò)敏患者的血清中存在對(duì)7S球蛋白有特異性的IgE抗體和對(duì)11S有特異性的IgG抗體。Ogawa等［9］利用人體血清中IgE抗體與致敏原相結(jié)合的特性，通過(guò)檢測(cè)69位過(guò)敏患者血清檢索出大豆蛋白質(zhì)多種成分的抗原性，發(fā)現(xiàn)Gly m Bd 30K、Gly m Bd 28K和Gly m Bd 60K是大豆中的三種主要致敏原。之后，有人對(duì)這3種主要的大豆過(guò)敏原結(jié)合表位等相關(guān)信息做了報(bào)道。

2.1 Gly m Bd 30K

Ogawa研究發(fā)現(xiàn)［8］Gly m Bd 30K 能被65%的大豆敏感個(gè)體血清所識(shí)別產(chǎn)生過(guò)敏癥狀，被認(rèn)為是致敏性最強(qiáng)的儲(chǔ)藏蛋白。在1996年Bando［27］對(duì)30K的糖基化位點(diǎn)進(jìn)行了研究，通過(guò)測(cè)定其氨基酸序列確定了抗體結(jié)合部位。30K的氨基酸順序如圖3所示［15］。經(jīng)氨基酸序列分析糖蛋白的結(jié)合位點(diǎn)位于多肽鏈170位天冬酞胺處。其多糖部分包括甘露糖，N－乙酞氨基葡萄糖，巖藻糖，木糖四種糖分子，其比例為 3∶2∶1∶1［23］。Hosoyama［28］等發(fā)現(xiàn) 30K 的 2 個(gè)重要抗原表位區(qū)F5和H6?？乖砦环治龀墒斓?0K蛋白至少有14個(gè)抗原表位，在30K的70位和170位的氨基酸存在兩個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)。P34的活性部位中的第38位半胱氨酸上擁有一個(gè)甘氨酸取代基，缺乏其家族中其他蛋白酶的半胱氨酸酶活性接觸位點(diǎn)。緊接著Helm等［29］研究發(fā)現(xiàn)了30K蛋白上其中5個(gè)主要的抗原表位分別被定于3～12、100～110、229～238、299～308 和 331～340 位的氨基酸殘基上，且不同的IgE抗原表位結(jié)合能力的差異顯著性因不同過(guò)敏病人血清而異。林蘇霞［30］等成功構(gòu)建的Gly m Bd 30k蛋白的抗原表位區(qū)單體為制備用于大豆主要過(guò)敏原檢測(cè)的試劑奠定了基礎(chǔ)。

圖3 Gly m Bd 30K氨基酸順序示意圖Fig.3 Amino acid sequence schematic of Gly m Bd 30K

2.2 Gly m Bd 60K

60K的mRNA帶有poly(A)尾，且在N－端含有一個(gè)22個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，去除信號(hào)肽后的前體肽為583個(gè)氨基酸，而成熟的60K由543個(gè)氨基酸形成［31］。Gly m Bd 60K 的氨基酸順序如圖 4 所示［32］。其IgE抗原表位位于不含糖基化位點(diǎn)的N－端232－383 殘基處［31］。Ogawa［14］等研究只證明了 α 亞基能被25%的大豆過(guò)敏患者的血清所識(shí)別，是β－伴大豆球蛋白組分中的一個(gè)過(guò)敏原。直到2009年，Krishnan［33］等研究發(fā)現(xiàn) Gly m Bd 60K 能與大豆敏感個(gè)體血清中IgE特異性結(jié)合而引起大豆過(guò)敏癥狀。

2.3 Gly m Bd 28K

Tsuji等［22］以單克隆抗體作為配體，用免疫親和柱層析法分離純化大豆主要過(guò)敏原中Gly m Bd 28K。28K的糖基化位點(diǎn)可能是IgE抗體識(shí)別的重要的表位，由473個(gè)氨基酸的多肽組成。Dolly［34］研究表明28K的N－末端與NBS－LRR型抗病花生蛋白有同源性，12個(gè)殘基序列為GRREDDYDNLQL;推導(dǎo)出的氨基酸序列與MP27/MP32具有高度的同源性，與南瓜蛋白中的存儲(chǔ)空泡蛋白有50.4%的同一性，與胡蘿卜蛋白之間有45.9%的同一性。Gly m Bd28K的致敏性為N－連接糖部分，并與大多過(guò)敏患者血清中的IgE抗體結(jié)合，其氨基酸順序如圖5所示［24］。有研究［35］發(fā)現(xiàn)在距28K多肽分子C端23ku處一個(gè)非常重要的IgE結(jié)合區(qū)域，這對(duì)大豆過(guò)敏原的研究具有重要意義。Hiemori等［36］發(fā)現(xiàn)，大豆過(guò)敏患者血清中IgE抗體識(shí)別位點(diǎn)為肽骨架第20位天冬酞胺連接的N－連接聚糖，此過(guò)敏原能引起約25%的大豆敏感個(gè)體產(chǎn)生過(guò)敏癥。Xiang［34］等研究發(fā)現(xiàn)，該過(guò)敏原肽鏈C端區(qū)域結(jié)合IgE的能力比N端區(qū)域更強(qiáng)，其抗原表位主要的線性C－末端抗原表面位于S256和A270之間，并定位了 Y260，D261，D262，K264 和 D266 這5個(gè)主要IgE結(jié)合的氨基酸殘基。

圖5 Gly m Bd 28K氨基酸順序示意圖Fig.5 Amino acid sequence schematic of Gly m Bd 28K

3 結(jié)論

隨著對(duì)Gly m Bd 28K、Gly m Bd 30K和Gly m Bd 60K三大主要大豆過(guò)敏原的普遍認(rèn)可，以及近年來(lái)食物過(guò)敏的嚴(yán)重性和發(fā)生頻率的不斷上升，食品過(guò)敏問(wèn)題必須重視。30、60、28K是目前發(fā)現(xiàn)的三種主要大豆蛋白過(guò)敏原，這些過(guò)敏原分子上分布著很多過(guò)敏原表位，IgE結(jié)合實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了許多表位的存在。已有應(yīng)用于大豆過(guò)敏原檢測(cè)的方法的研究，但還沒(méi)有形成靈敏度高、快速且成本低的檢測(cè)方法，且關(guān)于這三種過(guò)敏原結(jié)構(gòu)功能、抗原表位區(qū)域及致敏機(jī)理等的研究還不夠成熟，而這些相關(guān)生化特性的探究是建立大豆過(guò)敏原檢測(cè)及降低的重要理論依據(jù)。文章中僅總結(jié)了部分過(guò)敏原功能及表位的研究。更多的相關(guān)研究以及大豆蛋白中存在的其他過(guò)敏原也尚需探究。為了精確定位大豆主要過(guò)敏原表位，今后需進(jìn)一步研究構(gòu)成表位的必需氨基酸殘基、大豆抗原蛋白的完整組成，深入了解復(fù)雜的過(guò)敏反應(yīng)，揭示重要抗原蛋白的致敏機(jī)理，同時(shí)優(yōu)化和改進(jìn)大豆抗原檢測(cè)方法同樣具有潛在的需要。這些將為大豆蛋白過(guò)敏原掩蔽方法、改性大豆蛋白、開(kāi)發(fā)低敏性大豆蛋白制品提供重要的理論依據(jù)。

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