朱婷偉,陳復(fù)生,布冠好,孫 倩,劉昆侖
(河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院,河南鄭州450001)
大豆是我國(guó)種植面積最廣、食用最多而又廉價(jià)的植物蛋白資源,在食品工業(yè)中廣泛使用[1]。但同時(shí)大豆是8類主要致敏食物之一。大豆蛋白是存在于大豆種子中許多蛋白質(zhì)的總稱,成分按沉降系數(shù)不同分為2S組分8%~22%、7S組分35%、11S組分31%~52%、15S組分5%及存在的少量其他成分。其中,7S組分中約85%是β-伴大豆球蛋白;11S組分中約85%是大豆球蛋白[2]。大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白是大豆中蛋白質(zhì)的主要構(gòu)成成分,二者約占到70%。大豆過(guò)敏可引發(fā)過(guò)敏體質(zhì)人群產(chǎn)生Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng),目前在線過(guò)敏原數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄有41條大豆過(guò)敏原信息[3]。多項(xiàng)研究證實(shí),大豆蛋白過(guò)敏原會(huì)引起嬰幼兒、仔豬、犢牛、大鼠等幼齡動(dòng)物的過(guò)敏反應(yīng)[4]。約1%~6%的嬰幼兒對(duì)大豆過(guò)敏,隨著對(duì)大豆及大豆產(chǎn)品使用量的增加,成年人對(duì)大豆過(guò)敏的發(fā)生率也在日趨上升[5]。大豆過(guò)敏可引起胃腸道紊亂,皮炎性過(guò)敏,惡心、嘔吐,嚴(yán)重時(shí)還可導(dǎo)致休克和死亡[6]。近些年,有學(xué)者就主要過(guò)敏原的抗原表位,過(guò)敏原改性方法及檢測(cè)方法進(jìn)行了一定研究,但對(duì)大豆過(guò)敏原的抗原表位、結(jié)構(gòu)特性及過(guò)敏原的種類等研究還不夠完善。本文將對(duì)大豆蛋白主要過(guò)敏原的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié),為大豆蛋白過(guò)敏原結(jié)構(gòu)、抗原表位的完善及低敏性大豆蛋白制品的開(kāi)發(fā)提供重要的理論依據(jù)。
大豆抗原是大豆中的主要抗?fàn)I養(yǎng)因子之一,是能引起過(guò)敏反應(yīng)的一類蛋白質(zhì),亦稱大豆過(guò)敏原。Franck[7]研究發(fā)現(xiàn),不同的大豆產(chǎn)品中蛋白質(zhì)含量和抗原分布不同。大豆中發(fā)現(xiàn)有致敏性的蛋白如表1所示。其中7S球蛋白組分中的Gly m Bd 28K和Gly m Bd 30K和β-伴大豆球蛋白的α亞基Gly m Bd 60K是大豆中的主要致敏原[8]。
Gly m Bd 30K與P34的氨基酸組成和N端氨基酸序列一致,故又名P34。它是由257個(gè)氨基酸殘基組成的不溶于水的單分子糖蛋白,分子量約為34ku,等電點(diǎn)為5.79[15]。該蛋白能與β-伴大豆球蛋白的亞基通過(guò)二硫鍵結(jié)合來(lái)參與大豆蛋白的折疊。單曉紅[15]等對(duì)Gly m Bd 30K二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的結(jié)果顯示:α-螺旋占 29.29%,β-轉(zhuǎn)角占 5.28%,β-折疊占19.53%,無(wú)規(guī)則卷曲為45.91%。除部分α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角在蛋白質(zhì)的外側(cè),絕大部分β-折疊在蛋白質(zhì)的中間區(qū)域。P34與木瓜蛋白酶家族的三級(jí)構(gòu)象是一致的,屬于木瓜蛋白酶超家族。圖1為預(yù)測(cè)的P34的三級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖[15]。
30K主要存在于種子的子葉里,能與油體結(jié)合在一起。P34可能是植物對(duì)抗假單胞菌的一種防御蛋白,其生物學(xué)功能通過(guò)結(jié)合細(xì)菌分泌的丁香交酯而起防御的作用;有研究顯示P34的變種大豆還可作為調(diào)節(jié)丁香交酯分泌的信號(hào)感受器[16]。
β-伴大豆球蛋白包含α亞基、α'亞基和β亞基三個(gè)亞基,分子質(zhì)量分別約為68、71和50ku,它們以同源或異源的三聚體形式存在[17]。其中Gly m Bd 60K是由多糖與蛋白質(zhì)N端的天門冬氨酸結(jié)合而成,等電點(diǎn)為4.9。袁德保[18]等利用遠(yuǎn)紫外圓二色光譜對(duì)純化得到的β-伴大豆球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征,其中α亞基的二級(jí)結(jié)構(gòu)中,α-螺旋占9.8%,β-折疊占32.1%,β-轉(zhuǎn)角占22.8%,無(wú)規(guī)則卷曲占35.4%。其模擬的三級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖如圖2所示[19]。
表1 大豆中抗原蛋白及其相關(guān)性質(zhì)[9]Table 1 Allergen proteins in soybean and their relative characteristics[9]
圖1 預(yù)測(cè)的P34三級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Predicted tertiary structure of P34
圖2 Gly m Bd 60K的三維結(jié)構(gòu)示意圖Fig.2 Three-dimensional structure of Gly m Bd 60K
60K具有較好的熱穩(wěn)定性[20]。左偉勇提到有人從α亞基中提取到的soymetide-4能夠刺激人的多核白細(xì)胞的吞噬作用,且在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中能夠抑制服用抗癌藥所引起的禿毛癥;更有研究表明伴大豆球蛋白能刺激肝臟中的低密度脂蛋白受體,降低膽固醇的含量[21]。
Gly m Bd 28K是一種類蠶豆球蛋白,屬于Cupin超家族。它是大豆7S組分中的另一種重要的過(guò)敏原,包含了220個(gè)氨基酸殘基,分子質(zhì)量約為26ku,等電點(diǎn)為6.1[22]。28K的多糖分支鏈為β-1→2木糖和α-1→3巖藻糖,在植物體內(nèi)以寡聚體形式存在,推測(cè)的糖骨架為Man3GIcNAc[23]2,結(jié)構(gòu)為普通的β-桶形。28K的前體為C-末端的23ku肽,N266殘基的羧基側(cè)裂解發(fā)生28K與前體的轉(zhuǎn)換,且在28K中內(nèi)切酶可能與天冬氨酰肽鏈內(nèi)切酶功能類似,參與到植物蛋白的代謝過(guò)程中[24]。
引起人過(guò)敏的過(guò)敏原大多數(shù)是食物中的蛋白質(zhì),實(shí)質(zhì)上,與過(guò)敏反應(yīng)相關(guān)的是蛋白質(zhì)中部分抗原決定簇,又稱為表位[25]。Burks[26]的免疫印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大豆過(guò)敏患者的血清中存在對(duì)7S球蛋白有特異性的IgE抗體和對(duì)11S有特異性的IgG抗體。Ogawa等[9]利用人體血清中IgE抗體與致敏原相結(jié)合的特性,通過(guò)檢測(cè)69位過(guò)敏患者血清檢索出大豆蛋白質(zhì)多種成分的抗原性,發(fā)現(xiàn)Gly m Bd 30K、Gly m Bd 28K和Gly m Bd 60K是大豆中的三種主要致敏原。之后,有人對(duì)這3種主要的大豆過(guò)敏原結(jié)合表位等相關(guān)信息做了報(bào)道。
Ogawa研究發(fā)現(xiàn)[8]Gly m Bd 30K 能被65%的大豆敏感個(gè)體血清所識(shí)別產(chǎn)生過(guò)敏癥狀,被認(rèn)為是致敏性最強(qiáng)的儲(chǔ)藏蛋白。在1996年Bando[27]對(duì)30K的糖基化位點(diǎn)進(jìn)行了研究,通過(guò)測(cè)定其氨基酸序列確定了抗體結(jié)合部位。30K的氨基酸順序如圖3所示[15]。經(jīng)氨基酸序列分析糖蛋白的結(jié)合位點(diǎn)位于多肽鏈170位天冬酞胺處。其多糖部分包括甘露糖,N-乙酞氨基葡萄糖,巖藻糖,木糖四種糖分子,其比例為 3∶2∶1∶1[23]。Hosoyama[28]等發(fā)現(xiàn) 30K 的 2 個(gè)重要抗原表位區(qū)F5和H6??乖砦环治龀墒斓?0K蛋白至少有14個(gè)抗原表位,在30K的70位和170位的氨基酸存在兩個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)。P34的活性部位中的第38位半胱氨酸上擁有一個(gè)甘氨酸取代基,缺乏其家族中其他蛋白酶的半胱氨酸酶活性接觸位點(diǎn)。緊接著Helm等[29]研究發(fā)現(xiàn)了30K蛋白上其中5個(gè)主要的抗原表位分別被定于3~12、100~110、229~238、299~308 和 331~340 位的氨基酸殘基上,且不同的IgE抗原表位結(jié)合能力的差異顯著性因不同過(guò)敏病人血清而異。林蘇霞[30]等成功構(gòu)建的Gly m Bd 30k蛋白的抗原表位區(qū)單體為制備用于大豆主要過(guò)敏原檢測(cè)的試劑奠定了基礎(chǔ)。
圖3 Gly m Bd 30K氨基酸順序示意圖Fig.3 Amino acid sequence schematic of Gly m Bd 30K
60K的mRNA帶有poly(A)尾,且在N-端含有一個(gè)22個(gè)氨基酸的信號(hào)肽,去除信號(hào)肽后的前體肽為583個(gè)氨基酸,而成熟的60K由543個(gè)氨基酸形成[31]。Gly m Bd 60K 的氨基酸順序如圖 4 所示[32]。其IgE抗原表位位于不含糖基化位點(diǎn)的N-端232-383 殘基處[31]。Ogawa[14]等研究只證明了 α 亞基能被25%的大豆過(guò)敏患者的血清所識(shí)別,是β-伴大豆球蛋白組分中的一個(gè)過(guò)敏原。直到2009年,Krishnan[33]等研究發(fā)現(xiàn) Gly m Bd 60K 能與大豆敏感個(gè)體血清中IgE特異性結(jié)合而引起大豆過(guò)敏癥狀。
Tsuji等[22]以單克隆抗體作為配體,用免疫親和柱層析法分離純化大豆主要過(guò)敏原中Gly m Bd 28K。28K的糖基化位點(diǎn)可能是IgE抗體識(shí)別的重要的表位,由473個(gè)氨基酸的多肽組成。Dolly[34]研究表明28K的N-末端與NBS-LRR型抗病花生蛋白有同源性,12個(gè)殘基序列為GRREDDYDNLQL;推導(dǎo)出的氨基酸序列與MP27/MP32具有高度的同源性,與南瓜蛋白中的存儲(chǔ)空泡蛋白有50.4%的同一性,與胡蘿卜蛋白之間有45.9%的同一性。Gly m Bd28K的致敏性為N-連接糖部分,并與大多過(guò)敏患者血清中的IgE抗體結(jié)合,其氨基酸順序如圖5所示[24]。有研究[35]發(fā)現(xiàn)在距28K多肽分子C端23ku處一個(gè)非常重要的IgE結(jié)合區(qū)域,這對(duì)大豆過(guò)敏原的研究具有重要意義。Hiemori等[36]發(fā)現(xiàn),大豆過(guò)敏患者血清中IgE抗體識(shí)別位點(diǎn)為肽骨架第20位天冬酞胺連接的N-連接聚糖,此過(guò)敏原能引起約25%的大豆敏感個(gè)體產(chǎn)生過(guò)敏癥。Xiang[34]等研究發(fā)現(xiàn),該過(guò)敏原肽鏈C端區(qū)域結(jié)合IgE的能力比N端區(qū)域更強(qiáng),其抗原表位主要的線性C-末端抗原表面位于S256和A270之間,并定位了 Y260,D261,D262,K264 和 D266 這5個(gè)主要IgE結(jié)合的氨基酸殘基。
圖5 Gly m Bd 28K氨基酸順序示意圖Fig.5 Amino acid sequence schematic of Gly m Bd 28K
隨著對(duì)Gly m Bd 28K、Gly m Bd 30K和Gly m Bd 60K三大主要大豆過(guò)敏原的普遍認(rèn)可,以及近年來(lái)食物過(guò)敏的嚴(yán)重性和發(fā)生頻率的不斷上升,食品過(guò)敏問(wèn)題必須重視。30、60、28K是目前發(fā)現(xiàn)的三種主要大豆蛋白過(guò)敏原,這些過(guò)敏原分子上分布著很多過(guò)敏原表位,IgE結(jié)合實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了許多表位的存在。已有應(yīng)用于大豆過(guò)敏原檢測(cè)的方法的研究,但還沒(méi)有形成靈敏度高、快速且成本低的檢測(cè)方法,且關(guān)于這三種過(guò)敏原結(jié)構(gòu)功能、抗原表位區(qū)域及致敏機(jī)理等的研究還不夠成熟,而這些相關(guān)生化特性的探究是建立大豆過(guò)敏原檢測(cè)及降低的重要理論依據(jù)。文章中僅總結(jié)了部分過(guò)敏原功能及表位的研究。更多的相關(guān)研究以及大豆蛋白中存在的其他過(guò)敏原也尚需探究。為了精確定位大豆主要過(guò)敏原表位,今后需進(jìn)一步研究構(gòu)成表位的必需氨基酸殘基、大豆抗原蛋白的完整組成,深入了解復(fù)雜的過(guò)敏反應(yīng),揭示重要抗原蛋白的致敏機(jī)理,同時(shí)優(yōu)化和改進(jìn)大豆抗原檢測(cè)方法同樣具有潛在的需要。這些將為大豆蛋白過(guò)敏原掩蔽方法、改性大豆蛋白、開(kāi)發(fā)低敏性大豆蛋白制品提供重要的理論依據(jù)。
[1]江連洲,胡少新,李楊,等.大豆加工領(lǐng)域的科學(xué)技術(shù)問(wèn)題[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào),2011,11(9):98.
[2]劉賓.大豆主要過(guò)敏原的免疫檢測(cè)研究[D].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2011,2-5.
[3]鄭文杰,陳穎,曹際娟.食品中過(guò)敏原及其成分檢測(cè)[M].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2010:42-44.
[4]韓鵬飛,姜學(xué),馬曦.大豆抗原蛋白研究進(jìn)展[J].中國(guó)畜牧雜志,2009,45(19):69-72.
[5]Shannon W,Kristen B,Elvira G.Allergenic Proteins in Soybean:Processing and Reduction of P34 Allergenicity[J].Nutrition Reviews,2005,63(2):47-48.
[6]方旭前,朱友林,邱麗娟.大豆過(guò)敏原與低過(guò)敏原種質(zhì)創(chuàng)新[J].遺傳,2006,28(8):1043-1050.
[7]Franck P,Vautrin MD,Dousset B,et al.The allergenicity of soybean- based products is modified by food technologies[J].International Archives of Allergy and Immunology,2002,128(3):212-219.
[8]Ogawa T,Samoto M,Takahashi K.Soybean allergens and hypoallergenic soybean products[J].Nutritional Science and Vitaminology,2000,46(6):271-279.
[9]Ogawa T,Bando N,Tsuji H,et al.Investigations of the IgE-bingding proteins in soybeans by immunoblotting with sera from soybean-sensitive patients with atopic dermatitis[J].Nutritional Science and Vitaminology,1991,37(6):555-565.
[10]Rodrigo MJ,Morell F,Helm RM,et al.Identification and partial characterization of the soybean-dust allergen involved in the Barcelona asthma epidemic[J].Allergyand Clinical Immunology,1990,85(4):778-784.
[11]Julka S,Kuppannan K,Karnoup A,et al.Quantification of Gly m 4 protein,a major soybean allergen,by two-dimensional liquid chromatography with ultraviolet and mass spectrometry detection[J].Analytical Chemistry,2012,84(22),10019-10030.
[12]Hemrna EM,Melroy DL,Buckhout TJ.Apparent processing of a soybean oil body protein accompanies the onset of oil mobilization[J].Plant Physiology,1990,94(1):341-349.
[13]Kalinski A,Weisemann JM,Matthews BF,et al.Molecular cloning of a protein associated with soyben seed oil bodies that is similar to thiol proteases of the papain family[J].Biological Chemistry,1990,265(23):13843-13848.
[14]Liu B,Teng A,Yang Y,et al.Development of a competitive ELISA for the detection of soybean α subunit of β - conglycinin[J].process biochemistry,2012,47(2):280-287.
[15]單曉紅,孫秀蘭,管露,等.大豆主要過(guò)敏原Gly m Bd 30K抗原決定簇表征預(yù)測(cè)研究[J].分析科學(xué)學(xué)報(bào),2012,28(6):771-773.
[16]Ji C,Boyd C,Slaymaker D,et al.Characterization of a 34-kDa soybean binding protein for the syringolide elicitors[J].Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America,1998,95(6):3306-3311.
[17]Hei WJ,Li Z,Ma X,et al.Determination of beta-conglycinin in soybean and soybean products using a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay[J].Analytica Chimica Acta,2012,734(13):62-68.
[18]袁德保,楊曉泉,黃科禮.伴大豆球蛋白亞基色譜分離和制備及結(jié)構(gòu)表征[J].分析化學(xué)研究簡(jiǎn)報(bào),2010,38(6):877-880.
[19] Fu CJ,Jez JM,Kerley MS,etal.Identification,characterization,epitope mapping,and three- di- mensional modeling of the alpha-subunit of beta-conglycinin of soybean,a potential allergen for young pigs[J].Agricultural and Food Chemistry,2007,55(10):4014-4020.
[20]黃科禮,袁德保,鄭恒光,等.大豆伴球蛋白組成亞基組成亞基熱穩(wěn)定性及其相關(guān)影響因素分析[J].食品工業(yè)科技,2011,32(6):169-172.
[21]左偉勇.伴大豆球蛋白促雙歧桿菌增殖膚的分離和鑒定及其對(duì)腸道細(xì)菌區(qū)系的影響[D].南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2005,10-81.
[22]Tsuji H,Bando N,Hiemori M,et al.Purification and characterization of soybean allergen:Gly m Bd 28K[J].Bioscience Biotechnology and Biochemistry,1997,61(6):942-947.
[23]Liu B,Teng D,Wang X M,et al.Detection of the soybean allergenic protein Gly m Bd 28K by an indirect enzyme-linked immunosorbent assay[J].Agricultural and Food Chemistry,2013,61(4):822-828.
[24]Hiemori M,Ito H,Kimoto M,et al.Identification of the 23-kDa peptide derived from the precursor of Gly m Bd 28K,a major soybean allergen,as a new allergen[J].Biochimicaet Biophysica Acta,2004,1675(1-3):174-183.
[25]劉曉毅.大豆食源性致敏蛋白的識(shí)別、去除及脫敏后加工特性研究[D].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué),2005,8-10.
[26]Burks AW,Brooks JR,Sampson HA.Allergenicity of major component proteins of soybean determined by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)and immunoblotting in children with atopic dermatitis and positive soy challenges[J].Allergy and Clinical Immunology,1988,81(6):1135-1142.
[27]Bando N,Tsuji H,Yamanishi R,et al.Identification of the glycosylation site of a major soybean allergen,Gly m Bd 30K[J].Bioscience Biotechnology and Biochemistry,1996,60(2):347-348.
[28]Hosoyama H,Obata A,Bando N,et al.Epitope analysis of soybean major allergen Gly m Bd 30K recognized by the mouse monoclonal antibody using overlapping peptides[J].Bioscience Biotechnology and Biochemistry,1996,60(7):1181-1182.
[29]Helm RM,Cockrell G,Herman E.Celluar and molecular characterization of a major soybean allergen[J].International Archives of Allergy and Immunology,1998,117(1):29-37.
[30]林蘇霞,王曉梅,劉志剛,等.大豆主要過(guò)敏原Gly m Bd 30K的抗原表位區(qū)基因的克隆表達(dá)、純化及免疫原性鑒定[J].大豆科學(xué),2010,29(2):187-189.
[31]劉賓,滕達(dá),王建華.大豆主要致敏蛋白生化特性的研究進(jìn)展[J].中國(guó)飼料,2010(20):12-16.
[32]Zheng SG,Tian H,Ma N,et al.Purification and IgE-binding properties of soybean β - conglycinin subunits[J].Process Biochemistry,2012,47(12):2531-2537.
[33]Krishnan HB,Kim WS,Jang S,et al.All three subunits of soybean β - conglycinin are potential food Allergens[J].Agriculturial and Food Chemistry,2009,57(3):938-943.
[34]Dolly K,Naveen A,Ramkrashan K,et al.Isolation and characterization of a 28 kDa major allergen from blackgram(Phaseolus mungo)[J].Immunobiology,2012,217(9):895-904.
[35]Tsuji H,Hiemori M,Kimoto M,et al.Cloning of cDNA encoding a soybean allergen,Gly m Bd 28K[J].Biochimica et Biophysica Acta,2001,1518(1-2):178-182.
[36]Hiemori M,Bando N,Ogawa T,et al.Occurrence of IgE antibody-recognizing N-linked glycan moiety of a soybean allergen,Gly m Bd 28K[J].International Archives of Allergy and Immunology,2000,122:238-245.