聲致化學(xué)發(fā)光法應(yīng)用于水果中抗氧化劑對(duì)OH·清除能力的研究

魯 芳，段 晶，聶迎春，毛青青，呂家根，*

(1.陜西師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，陜西西安710062;2.青海師范大學(xué)化學(xué)系，青海西寧810008)

研究證明［1－2］，足夠強(qiáng)度的超聲波可以產(chǎn)生空化現(xiàn)象，在空化氣泡崩塌的瞬間可以產(chǎn)生高溫、高壓的熱點(diǎn)，并伴隨聲致發(fā)光?？栈a(chǎn)生的這些極端的物理?xiàng)l件和能量足以使 H2O發(fā)生裂解，產(chǎn)生OH·［2－6］。如果溶液中存在化學(xué)發(fā)光試劑，如 luminol(魯米諾)、lucigenin(光澤精)等，則與超聲所產(chǎn)生的自由基迅速氧化發(fā)光試劑產(chǎn)生很強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光，被稱之為聲致化學(xué)發(fā)光(sonochemiluminescence，SCL)［7－8］。有關(guān)超聲空化產(chǎn)生 OH·和 SCL 已有許多深入的研究［6，9－10］，并且推斷出 SCL 強(qiáng)度與 OH·的量有關(guān)。由此可見，超聲可作為一種OH·的生成源，而SCL可作為定量測量水溶液中OH·的有效工具?；诖耍琒CL法可以實(shí)現(xiàn)抗氧化劑清除OH·能力的評(píng)價(jià)。目前，已有的抗氧化性的研究方法［11－17］，都是通過測量剩余的OH·的量來間接測定抗氧化劑清除OH·的能力。然而，由于OH·的反應(yīng)活性大，壽命短、存在濃度低，其本身很難單獨(dú)穩(wěn)定存在。因此，這些方法也就受到了一定的約束，而SCL具有如下潛在的優(yōu)勢:物試劑的產(chǎn)生OH·可以僅僅對(duì)抗氧化劑清除OH·的能力進(jìn)行評(píng)價(jià);能在線、均相產(chǎn)生OH·使整個(gè)反應(yīng)避免混合和擴(kuò)散過程的影響;聲致化學(xué)發(fā)光與OH·的產(chǎn)生同步進(jìn)行，可以獲得對(duì)OH·的直接、靈敏、快速的測定;使用儀器及實(shí)際簡單?；诖耍緦?shí)驗(yàn)構(gòu)建了SCL分析法并應(yīng)用于抗氧化劑對(duì)OH·的清除能力的評(píng)價(jià)，利用水在聲場作用下產(chǎn)生的OH·，OH·氧化luminol發(fā)出強(qiáng)烈的聲致化學(xué)發(fā)光，而抗氧化劑的加入將會(huì)猝OH·因而清除聲致化學(xué)發(fā)光，通過測量SCL的清除情況可以實(shí)現(xiàn)抗氧化劑對(duì)OH·清除能力的評(píng)價(jià)。眾所周知，水果不僅可以提供人體所需的維生素、礦物質(zhì)和纖維素等，而且還含有許多植物抗氧化物質(zhì)，如VC、VE、類黃酮、花色素等，這些物質(zhì)具有較強(qiáng)的抗氧化活性，因此，在最優(yōu)條件下，對(duì)柳葉桔、草莓、圣女果、獼猴桃、蘋果、西瓜、油桃、菠蘿、甜瓜、大紅柚、火龍果、贛南臍橙十二種水果在體外模擬生理?xiàng)l件下的OH·清除能力進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

柳葉桔、草莓、圣女果、獼猴桃、蘋果、西瓜、油桃、菠蘿、甜瓜、大紅柚、火龍果、贛南臍橙 均購自當(dāng)?shù)爻小?/p>

水果抗氧化劑儲(chǔ)備液 十二種水果取果肉部分，各稱取50.0g于200.0mL二次水中，勻漿5min，減壓過濾，濾液2000 r/min離心5min，收集上層液備用。

Luminol 陜 西師 范 大學(xué) 自制;NaCl、KCl、KH2PO4、NaHPO4·12H2O 分析純，均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

(1)0.01 mol/L pH7.4 PBS緩沖液 準(zhǔn)確稱取NaCl 0.80g，KCl 0.20g，KH2PO40.20g，Na2HPO4·12H2O 2.90g，二次水溶解并定容于1000mL容量瓶中，充分搖勻備用。

(2)1.0×10－2mol/L luminol儲(chǔ)備液 準(zhǔn)確稱取luminol 1.772g，用0.01mol/L NaOH溶解后，二次水定容于1000mL棕色容量瓶中，放置暗處保存，兩周使用。使用時(shí)，用pH7.4 PBS緩沖液稀釋至所需濃度實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾去離子水。

MPI－A型多功能化學(xué)發(fā)光/生物發(fā)光分析系統(tǒng)西安瑞邁電子科技有限公司;DH48S－S時(shí)間繼電器 上海卓一電子有限公司;超聲發(fā)生器 由商品化儀器改裝，功率為35W;陶瓷電壓片 深圳市安之能電子技術(shù)有限公司;多功能食品加工機(jī) 香港福爾康有限公司;H－1650高速離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.2 SCL分析裝置構(gòu)造

SCL分析裝置如圖1所示。儀器裝置由化學(xué)發(fā)光儀、光電倍增光、計(jì)算機(jī)、時(shí)間繼電器、超聲發(fā)生器、聲致發(fā)光池、注射器、廢液管鏈接構(gòu)成。

圖1 聲致化學(xué)發(fā)光分析示意圖Fig.1 Schematic diagram of the SCL system

在光電倍增管暗盒內(nèi)安裝聲致化學(xué)發(fā)光池。聲致化學(xué)發(fā)光池由一個(gè)地部半徑2.5cm，體積15mL的玻璃小瓶加工而成，用砂輪將玻璃瓶底部打磨掉，以環(huán)氧樹脂粘結(jié)一相同直徑的陶瓷電壓片，陶瓷電壓片的正負(fù)兩極分別通過導(dǎo)線與超聲發(fā)生器連接。玻璃瓶口用橡膠塞蓋住并用環(huán)氧樹脂膠密封，橡膠塞上分別插上三根內(nèi)徑為1mm聚氯乙烯管，其中兩短一長，兩個(gè)短管分別用于進(jìn)樣和保持聲致化學(xué)發(fā)光池內(nèi)外氣壓平衡，長度為1cm，長管用于廢液的輸出，為6cm。樣品管和廢液管連接一段硅膠管傳出光電倍增管殼體外，聲致化學(xué)發(fā)光池池體周圍包一層錫紙用來減少光的反射，增強(qiáng)聲致化學(xué)發(fā)光，留1cm寬的狹縫作為聲致化學(xué)發(fā)光的入射縫。一定體積的樣品溶液通過注射器推入到聲致化學(xué)發(fā)光池后，打開時(shí)間繼電器，時(shí)間繼電器按設(shè)置好的工作模式循環(huán)開關(guān)，當(dāng)溶液受到超聲輻射時(shí)，發(fā)出SCL信號(hào)，超聲停止則SCL消失。光電倍增管將接收到的信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)輸入計(jì)算機(jī)，計(jì)算機(jī)對(duì)輸入的信號(hào)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并記錄SCL隨時(shí)間的譜圖，根據(jù)譜圖逢高進(jìn)行定量分析。一次測定結(jié)束后，用注射器將池體中的廢液抽出，用超純水清洗3次后，重復(fù)以上過程，進(jìn)行下一次測定。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

將流路圖按圖1所示連接，開啟化學(xué)發(fā)光儀，超聲發(fā)生器，設(shè)置化學(xué)發(fā)光儀負(fù)高壓為600V。分別進(jìn)行聲致化學(xué)發(fā)光池中溶液體積、超聲脈沖作用時(shí)間、超聲脈沖間隔以及l(fā)uminol濃度對(duì)SCL強(qiáng)度和精密度影響的考察。

1.3.1 聲致化學(xué)發(fā)光池溶液體積的考察 聲致化學(xué)發(fā)光池中溶液體積影響SCL的強(qiáng)度和精密度。在固定luminol濃度為1.0×10－6mol/L，超聲脈沖作用時(shí)間為0.5s，超聲脈沖間隔時(shí)間為10s的情況下，分別考察在1.0～10.0mL不同溶液體積對(duì)SCL強(qiáng)度和精密度的影響。

1.3.2 超聲脈沖作用時(shí)間的考察 超聲脈沖作用時(shí)間影響SCL的強(qiáng)度和精密度。在固定luminol濃度為1.0×10－6mol/L，超聲脈沖間隔時(shí)間為10s，聲致化學(xué)發(fā)光池中溶液體積為5mL的情況下，考察了在0.1～10s時(shí)間范圍內(nèi)超聲脈沖作用時(shí)間對(duì)SCL強(qiáng)度和精密度的影響。

1.3.3 超聲脈沖間隔的考察 超聲脈沖間隔影響SCL的強(qiáng)度和精密度。在固定luminol濃度為1.0×10－6mol/L，超聲脈沖作用時(shí)間為0.1s，聲致化學(xué)發(fā)光池中溶液體積為5mL的情況下，考察了在2～18s時(shí)間范圍內(nèi)超聲脈沖間隔時(shí)間對(duì)SCL強(qiáng)度和精密度的影響。

1.3.4 luminol濃度的考察 發(fā)光試劑luminol濃度是影響SCL強(qiáng)度和精密度的決定因素。在超聲脈沖作用時(shí)間為0.1s，超聲脈沖間隔時(shí)間為10s，聲致化學(xué)發(fā)光池中溶液體積為5mL的情況下，考察了在1.0×10－7～1.0 ×10－3mol/L 范圍內(nèi)不同濃度的 luminol溶液對(duì)SCL強(qiáng)度和精密度的影響。

1.3.5 水果抗氧化能力的測定 在luminol濃度為1.0×10－3mol/L，超聲脈沖作用時(shí)間為0.1s，超聲脈沖間隔時(shí)間為10s，聲致化學(xué)發(fā)光池中溶液體積為5mL的最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)選定的十二種水果的抗氧化能力進(jìn)行了測定。具體操作如下:準(zhǔn)確移取2.5mL，1.0×10－3mol/L魯米諾溶液和2.5mL二次水于10mL燒杯中，用注射器將5.0mL將溶液導(dǎo)入聲致化學(xué)發(fā)光池，開啟時(shí)間繼電器，超聲發(fā)生器按設(shè)定的時(shí)間循環(huán)工作5次，檢測到的聲致化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度為I0，關(guān)閉時(shí)間繼電器，用注射器將聲致化學(xué)發(fā)光池中的廢液導(dǎo)出，用二次水將其清洗3次;準(zhǔn)確移取2.5mL，1.0×10－3mol/L魯米諾溶液和2.5mL不同濃度的樣品溶液于10mL燒杯中，重復(fù)以上測定，檢測到聲致化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度為I，以清除率表示抗氧化活性的能力強(qiáng)弱。

2 結(jié)果與討論

2.1 聲致化學(xué)發(fā)光池溶液體積的影響

圖2顯示了在1.0～10.0mL不同溶液體積對(duì)SCL強(qiáng)度和精密度的影響。結(jié)果表明，當(dāng)溶液體積小于5.0mL，SCL強(qiáng)度隨樣品體積的增大而增大，超過5.0mL，SCL強(qiáng)度增大的趨勢不明顯。從測定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值可以看出，當(dāng)溶液體積為5.0mL時(shí)可以得到最好的精密度。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用溶液體積為5.0mL。

圖2 溶液體積對(duì)聲致化學(xué)發(fā)光重現(xiàn)性的影響Fig.2 The effect of solution vloume on SCL

2.2 超聲脈沖作用時(shí)間的影響

圖3顯示了在0.1～10s時(shí)間范圍內(nèi)，超聲脈沖時(shí)間對(duì)SCL體系強(qiáng)度和精密度的影響。結(jié)果表明，當(dāng)超聲脈沖作用時(shí)間越長體系的精密度越差，當(dāng)超聲脈沖作用時(shí)間為0.1s時(shí)，體系的精密度最好。這可能是由于超聲空化氣泡崩塌時(shí)所產(chǎn)生的瞬間高溫帶來的熱量累積使得體系本體溶液的溫度不斷上升，而本體溶液的溫度變化恰恰不利于SCL分析體系的精密度。因此，相對(duì)短的超聲脈沖作用時(shí)間有利于得到相對(duì)好的重現(xiàn)性。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，選擇超聲脈沖作用時(shí)間為0.1s。

圖3 超聲脈沖時(shí)間td對(duì)聲致化學(xué)發(fā)光重現(xiàn)性的影響Fig.3 The effect of ultrasonic pulse duration tdon SCL

2.3 超聲脈沖間隔的影響

如圖4顯示了在2～18s范圍內(nèi)，考察了超聲脈沖間隔對(duì)SCL強(qiáng)度和精密度的影響。結(jié)果表明，超聲脈沖時(shí)間間隔越長，體系的精密度越好，超聲脈沖間隔超過10s后，體系的精密度基本趨于平穩(wěn)，因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，選擇超聲脈沖間隔為10s。

圖4 超聲脈沖時(shí)間間隔ti對(duì)聲致化學(xué)發(fā)光重現(xiàn)性的影響Fig.4 The effect of ultrasonic pulse duration interval tion SCL

2.4 luminol濃度的影響

圖5顯示了在 1.0 ×10－7～1.0 ×10－3mol/L 范圍內(nèi)，luminol不同濃度對(duì)SCL強(qiáng)度和精密度的影響。結(jié)果表明，發(fā)現(xiàn)隨魯米諾濃度的增大，SCL強(qiáng)度逐漸增大，當(dāng)濃度為1.0×10－3mol/L時(shí)發(fā)光強(qiáng)度最大且有很好的精密度。此外，相對(duì)于超聲所產(chǎn)生的OH·的濃度，這一濃度下luminol分子已經(jīng)大大過量，可以保證超聲所產(chǎn)生的OH·完全反應(yīng)，因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選用魯米諾濃度為1.0×10－3mol/L。

圖5 魯米諾濃度對(duì)聲致化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響Fig.5 The effect of luminol concentration on SCL

2.5 緩沖溶液的選擇

為了實(shí)現(xiàn)模擬生理?xiàng)l件下的體外測定抗氧化劑清除OH·的能力，我們選擇使用pH7.4的生理緩沖液?？紤]到OH·的強(qiáng)氧化性和超聲空化對(duì)有機(jī)物的降解作用，我們選擇使用純無機(jī)鹽PBS緩沖溶液。

2.6 十二種水果的抗氧化性的比較

在最優(yōu)條件下，實(shí)驗(yàn)考察了在SCL體系中加入不同濃度的柳葉桔、草莓、圣女果、獼猴桃、蘋果、西瓜、油桃、菠蘿、甜瓜、大紅柚、火龍果、贛南臍橙水果汁液后對(duì)SCL強(qiáng)度的影響，并計(jì)算了相應(yīng)的清除率，結(jié)果如表1所示。

一般用發(fā)光清除率的50%的樣品濃度IC50值來評(píng)價(jià)樣品對(duì) OH·的清除能力。IC50越小，樣品清除OH·的能力越強(qiáng)，反之，IC50越大，樣品清除OH·的能力越弱。由表2中的線性方程計(jì)算出十二種水果的IC50值。結(jié)果表明，贛南臍橙清除OH·的能力最強(qiáng)，甜瓜清除OH·的能力最弱。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，不同水果的抗氧化活性存在較大的差異，主要的原因除了種類不同外，可能的影響因素還包括水果采收時(shí)的成熟度、種植生長條件、地域差異、采收后的貯存條件、抗氧化活性物質(zhì)在水果中含量的高低、抗氧化物質(zhì)組成以及不同的抗氧化活性物質(zhì)相互之間的作用有關(guān)。從抗氧化性方面分析，所測的十二種水果的抗氧化活性與文獻(xiàn)中測定的結(jié)果基本一致［19－22］，對(duì)自由基的清除活性順序?yàn)橼M南臍橙＞大紅柚＞柳葉桔＞菠蘿＞獼猴桃＞草莓＞火龍果＞圣女果＞蘋果＞油桃＞西瓜＞甜瓜。最強(qiáng)的與最弱的相差6倍。

表1 12種水果對(duì)OH·清除的結(jié)果Table 1 The OH·scavenging capacities of twelve kinds of fruits

續(xù)表

表2 12種水果的OH·清除率與聲致化學(xué)發(fā)光的關(guān)系(n=5)Table 2 The linear relationship between the term，SCL and the OH·scavenging capacities of twelve kinds of fruits(n=5)

3 結(jié)論

3.1 采用SCL分別測定了十二種水果對(duì)OH·清除的能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，十二種水果清除自由基的活性順序?yàn)?贛南臍橙＞大紅柚＞柳葉桔＞菠蘿＞獼猴桃＞草莓＞火龍果＞圣女果＞蘋果＞油桃＞西瓜＞甜瓜。

3.2 我們建立的SCL法，具有分析頻率高、穩(wěn)定性好、操作簡單、安全快速、耗費(fèi)低、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，可用于多種果蔬、飲料制品、天然產(chǎn)物及藥物的抗氧化性的研究，進(jìn)一步拓寬了聲致化學(xué)發(fā)光法的應(yīng)用領(lǐng)域。

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