超聲波輔助提取黃秋葵多酚和多糖的工藝研究

劉怡彤，段振華，2，* ，馬華林，李 霜，張 雄，李婧怡

(1.海南大學食品學院，海南海口570228;2.海南大學熱帶生物資源教育部重點實驗室，海南?？?70228)

黃秋葵(Abelmoschus esculentus(L.)Moench)，為錦葵科秋葵屬一年生草本植物，別名秋葵夾、羊角豆等，原產(chǎn)于非洲，現(xiàn)在全國各地均有栽培［1］。黃秋葵含有豐富的蛋白質、游離氨基酸、礦物質、多糖、黃酮和多酚類化合物等多種生物活性成分［2－4］。豐富的生物活性物質使得黃秋葵具有抗疲勞［5］、提高機體免疫力、減少肺損傷和抗癌等作用［6－7］，臨床上已經(jīng)應用于治療皮膚癌［8］、燙燒傷等疾病的治療。有研究表明［9］黃秋葵多糖具有體外結合膽酸的能力。多酚具有較強的清除自由基、抗氧化活性、抗腫瘤、抗輻射以及保護心血管系統(tǒng)等重要的生物活性功能［10］，但關于黃秋葵多酚的研究卻鮮有報道。因此開發(fā)研究黃秋葵多糖和多酚，對于黃秋葵資源的充分利用具有積極意義。超聲波輔助提取技術利用機械及熱力學特征產(chǎn)生極大的沖擊力與剪切力，產(chǎn)生空化作用，使細胞破碎，通過提高破碎速度來提高提取效率［11］。利用超聲波技術輔助提取植物中活性物質具有減少溶劑用量，減少提取時間，降低提取溫度等優(yōu)點［12－14］。本實驗以新鮮黃秋葵為原料，采用超聲波輔助提取技術，對黃秋葵水提液中多酚和多糖進行研究，通過單因素和正交實驗確定黃秋葵中多酚和多糖水提取的最佳工藝條件，以期為黃秋葵的產(chǎn)品研發(fā)和有效開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃秋葵新鮮嫩果 海口市南國超市;沒食子酸分析標準品(純度＞99%) 阿拉丁試劑公司;福林酚(FC)、碳酸鈉、無水葡萄糖、苯酚、濃硫酸 均為國產(chǎn)分析純。

KS－300E超聲波清洗機 寧波科生儀器廠;101－2型電熱鼓風恒溫干燥箱 常州市華普達教學儀器有限公司;7200可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司;IKA A11 basic分析用研磨機 德國儀科;HH－S26S電熱恒溫水浴鍋 金壇市大地自動化儀器廠;BS124S電子天平 Sartorius公司;SHB－Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;TDZ5－WS多管架自動平衡離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取工藝流程 新鮮黃秋葵→蒸餾水清洗→去蒂→打漿→加入一定量蒸餾水→攪拌均勻→超聲處理→抽濾→濾液離心→提取液

1.2.2 多酚的測定 標準曲線的測定:采用福林－酚法［15］。精密稱取20mg沒食子酸標準品，蒸餾水溶解并定容至 200mL，分別吸取 0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL標準品溶液，各補水至0.5mL。然后加入10%FC試劑2.5mL，充分搖勻。反應5min后加入7.5%Na2CO3溶液5mL，50℃水浴鍋中反應5min。室溫避光保存1h。于波長760nm處測定吸光度。標準曲線回歸方程結果為:Y=5.3986X+0.0202，R2=0.9954，其中Y:吸光度;X:沒食子酸質量濃度(mg/mL)。

樣品測定:吸取提取液0.5mL，按上述步驟操作測定吸光度，以標準曲線回歸方程和料液比計算黃秋葵多酚得率。

1.2.3 多酚含量的計算 根據(jù)公式計算多酚得率:多酚含量(mg/g)=黃秋葵多酚質量(mg)/黃秋葵質量(g)。

1.2.4 多糖的測定 標準曲線的測定:采用苯酚－硫酸法［16］。精密稱取100mg干燥至恒重的葡萄糖，蒸餾水溶解并定容至1000mL，分別吸取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL葡萄糖溶液，各補水至1.0mL。然后加入6%苯酚溶液1mL，充分搖勻后加入濃硫酸5mL，迅速搖勻后室溫放置30min，于波長490nm處測定吸光度。標準曲線回歸方程結果為:Y=9.5871X+0.0065，R2=0.9983，其中 Y:吸光度;X:葡萄糖質量濃度(mg/mL)。

樣品測定:量取一定量提取液，加入三倍量95%乙醇，于4℃冰箱過夜保存。抽濾取沉淀后復溶于水。取1mL復溶液，按上述步驟操作測定吸光度，以標準曲線回歸方程和料液比計算黃秋葵多糖得率。

1.2.5 多糖含量的計算 多糖含量(mg/g)=黃秋葵多糖質量(mg)/黃秋葵質量(g)

1.2.6 單因素實驗 選定超聲時間、料液比、超聲溫度和超聲功率四個因素作單因素實驗，在其他因素不變的情況下，考察各個單因素對黃秋葵多酚和多糖得率的影響。

1.2.7 正交實驗 根據(jù)單因素實驗結果，以超聲時間、料液比、超聲溫度和超聲功率為考察因素，設計4因素3水平的正交實驗，對超聲提取黃秋葵水溶液多酚和多糖的工藝進行優(yōu)化。因素水平設計見表1。

表1 工藝優(yōu)化L9(34)正交實驗因素水平表Table 1 Factors and their levels in L9(34)orthogonal array design

2 結果與分析

2.1 超聲時間對黃秋葵多酚和多糖含量的影響

固定料液比為1∶40，超聲溫度為50℃，超聲功率為120W，改變超聲時間為 30、60、90、120、150min?？疾斐晻r間對黃秋葵多酚和多糖含量的影響。結果如圖1所示。

圖1 超聲時間對含量的影響Fig.1 Effect of ultrasound treatment time on yield

由圖1可以看出，隨著超聲時間的增加，多酚和多糖的含量先明顯增大，當時間增加至90min時，隨著時間的繼續(xù)增加，得率又出現(xiàn)減小的趨勢。這可能是因為長時間的超聲處理破壞了產(chǎn)物結構，加劇了多酚物質的氧化，導致多酚含量下降;同時使得大分子多糖的糖苷鍵斷裂，從而導致多糖含量下降［17］。

2.2 料液比對黃秋葵多酚和多糖含量的影響

固定超聲時間為90min，超聲溫度為50℃，超聲功率為 120W，改變料液比為 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50?？疾炝弦罕葘S秋葵多酚和多糖含量的影響。結果如圖2所示。

圖2 料液比對含量的影響Fig.2 Effect of material/liquid ratio on yield

由圖2可以看出，隨著料液比的增大，多酚含量呈現(xiàn)明顯增加趨勢，在1∶40料液比時出現(xiàn)最大值，隨后減小。多糖增加趨勢較為平緩，也在1∶40出現(xiàn)最大值。這可能是因為隨著料液比的增大，細胞壁內(nèi)外的物質濃度差增大，增大了擴散速度，從而促進物質溶出。而當料液比增加到一定程度之后，水分子分散了超聲波對有效成分的作用，導致細胞破碎不完全，從而降低得率［18］。

2.3 超聲溫度對黃秋葵多酚和多糖含量的影響

固定超聲時間 90min，料液比1∶40，超聲功率120W，改變超聲溫度為 30、40、50、60、70℃?？疾斐暅囟葘S秋葵多酚和多糖含量的影響。結果如圖3所示。

圖3 超聲溫度對含量的影響Fig.3 Effect of ultrasound temperature on yield

由圖3可以看出，在30～40℃時，多酚和多糖含量都有所增加，40℃之后，隨著溫度增加，兩者得率均持續(xù)減小，在60℃之后變化平緩。因為黃秋葵酚類化合物在較高的溫度下容易發(fā)生氧化，所以溫度的升高會導致多酚含量下降;提取溫度過高也會引起水溶性多糖分子結構的破壞［19］。隨后含量變化平緩，這可能是因為大部分多酚與多糖已被高溫破壞，只有少量結構穩(wěn)定的酚類與多糖未被破壞，溶解于提取液中。因此提取溫度選在40℃。

2.4 超聲功率對黃秋葵多酚和多糖含量的影響

固定超聲時間為90min，料液比為1∶40，超聲溫度為 40℃，改變超聲功率為 48、72、96、120、144W?？疾斐暪β蕦S秋葵多酚和多糖得率的影響。結果如圖4所示。

圖4 超聲功率對含量的影響Fig.4 Effect of ultrasound power on yield

由圖4可以看出，在超聲功率低于96W時，隨功率增大多酚含量明顯增大，當超聲功率超過96W時，隨功率增大多酚含量逐漸減小。多糖在72W時出現(xiàn)最大值，72W與96W含量略有減小，但相差不大，因此考慮到多酚在96W出現(xiàn)最大值，超聲功率選在96W。多酚與多糖含量均先增大后減小可能是因為隨著功率增大，超聲波空化作用更劇烈，分子擴散就越劇烈。而當超聲波功率達到一定值時會對多酚和多糖產(chǎn)生破壞作用，引起多酚和多糖物質的分解［14，20］。

2.5 正交實驗結果與分析

根據(jù)表1正交實驗設計表進行四因素三水平正交實驗，實驗結果見表2。

由表2可以看出，影響黃秋葵多酚含量的因素次序為A＞C＞B＞D，最優(yōu)組合為A2B3C3D2，影響黃秋葵多糖得率的因素次序為C＞A＞D＞B，最優(yōu)組合為A2B3C3D1。黃秋葵多酚與多糖的最優(yōu)組合僅僅在D功率因素上存在差異?？紤]到在多酚和多糖兩種物質中，目前對黃秋葵的研究主要集中在黃秋葵多糖，有大量研究表明黃秋葵多糖具有很多功能活性［9，21－23］，故選擇多糖的最優(yōu)組合 A2B3C3D1為最佳工藝條件即超聲時間90min，超聲溫度45℃，料液比1∶45，超聲功率84W。

表2 正交實驗結果Table 2 Results of orthogonal test

選取超聲時間90min，超聲溫度45℃，料液比1∶45，超聲功率84W進行三次平行實驗，實驗結果平均值為:多酚含量為 4.207mg/g，多糖含量為2.671mg/g。均高于正交實驗結果，說明該工藝條件穩(wěn)定可行。

3 結論

超聲波輔助水提取黃秋葵多酚和多糖的最佳工藝條件為超聲時間90min，超聲溫度45℃，料液比1∶45，超聲功率84W，其中超聲時間是影響多酚和多糖得率的最主要因素。在該條件下水提取黃秋葵多酚和多糖的含量分別為4.207、2.671mg/g。

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