藍萼香茶菜的抗補體活性成分研究

姚士，徐乃玉，褚純雋，張健，陳道峰

[摘要] 目的：在前期研究基礎(chǔ)上，深入研究藍萼香茶菜的化學(xué)成分及其抗補體活性。方法：通過溶血試驗，對藍萼香茶菜各部位進行抗補體活性測試，以抗補體活性作為導(dǎo)向分離手段，運用多種色譜方法分離純化藍萼香茶菜中的化學(xué)成分，采用現(xiàn)代譜學(xué)技術(shù)進行結(jié)構(gòu)鑒定，確定抗補體活性成分。結(jié)果：藍萼香茶菜的正丁醇部位活性較強，從藍萼香茶菜中分離得到11個化合物，分別為豆甾醇（1），豆甾醇-9（11）-烯-3-醇（2），藍萼丁素（3），尾葉香茶菜丙素（4），山楂酸（5），科羅索酸（6），minheryinsⅠ（7），香葉木素（8），咖啡酸乙烯酯（9），咖啡酸（10），牡荊苷（11）?？寡a體活性實驗表明，化合物9，10以及前期分離得到的異槲皮苷、蘆丁、槲皮素、槲皮素-3-甲醚、木犀草素、木犀草素-7-甲醚和芹菜素對經(jīng)典途徑的補體激活具有不同程度的抑制作用。結(jié)論：化合物2，4，6～9，11為首次從該植物中獲得，咖啡酸的抗補體活性最強，CH₅₀為0.041 g·L^-1。

[關(guān)鍵詞] 藍萼香茶菜； 化學(xué)成分； 咖啡酸乙烯酯； 抗補體活性

藍萼香茶菜為唇形科香茶菜屬植物，分布于中國東北、華北和吉林省長白山地區(qū)，資源極為豐富，藍萼香茶菜有抗菌消炎和抗癌活性，用于胃炎、肝炎初起、感冒發(fā)熱、乳腺炎、關(guān)節(jié)痛等疾病[1]。在前期工作中本課題組對藍萼香茶菜的化學(xué)成分進行研究，分離得到芹菜素等化合物[2-3]，體外抗溶血實驗表明該植物的正丁醇部位具有抗補體活性，為了深入研究其抗補體活性成分并為進一步開發(fā)利用該藥材奠定基礎(chǔ)，本文分離得到11個化合物，通過NMR，MS等手段鑒定了其結(jié)構(gòu)，并對從藍萼香茶菜中得到的部分化合物進行抗補體活性篩選。結(jié)果表明化合物9，10以及前期分離得到的異槲皮苷，蘆丁，槲皮素，槲皮素-3-甲醚，木犀草素，木犀草素-7-甲醚，芹菜素對經(jīng)典途徑的補體激活具有抑制作用，其中咖啡酸的抑制作用最強，50%抑制溶血濃度（CH₅₀）為0.041 g·L^-1。

1 材料

2051型紫外-可見分光光度儀；Nicolet Impact 410型紅外光譜儀；HP5989A質(zhì)譜儀；Brucker ACF-300，400型核磁共振儀；制備液相，包括慧德易QuikSep高壓泵，慧德易QuikSep檢測器；YMC色譜柱（20 mm×250 mm，5 μm）。Sephadex LH-20為GE Healthcare產(chǎn)品，Amberchrom CG161M為慧德易公司分裝ROHMHAAS型。薄層色譜和柱色譜用硅膠均為青島海洋化工廠產(chǎn)品，高效薄層色譜板為煙臺市化學(xué)工業(yè)研究所煙臺化工科技開發(fā)實驗廠產(chǎn)品，所用試劑均為分析純。

藥材采自黑龍江省鐵力市桃山林業(yè)局白河林場，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)王振月教授鑒定為藍萼香茶菜Rabdosia japonica var. glaucocalya（Maxim.）Hara，標(biāo)本保存在黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)標(biāo)本館。

豚鼠（200～250 g），雌雄不限，復(fù)旦大學(xué)實驗動物部提供[合格證編號SCXK（瀘）2009-1038]。綿羊紅細胞（SRBC）和溶血素由復(fù)旦大學(xué)藥理教研室章蘊毅副教授提供。

2 方法

2.1 提取分離

藍萼香茶菜地上部分50 kg，以95%乙醇提取3次，提取液濃縮，得流浸膏10 L，將其溶解在水中，經(jīng)石油醚萃取脫脂，再分別以三氯甲烷、正丁醇依次萃取，得相應(yīng)萃取物為600，960 g。

三氯甲烷萃取物經(jīng)硅膠柱色譜，三氯甲烷-甲醇（100∶0～2∶1）進行梯度洗脫，得到8個部分。Fr.2經(jīng)硅膠柱色譜，三氯甲烷-甲醇（100∶1～80∶1）洗脫，得到化合物1（12 mg），2（21 mg）；Fr.6經(jīng)三氯甲烷重結(jié)晶得到化合物3（40 mg），母液回收三氯甲烷后殘渣再用三氯甲烷-甲醇（4∶1）結(jié)晶得到化合物4（60 mg）；Fr.7采用液相制備，以80%甲醇作為流動相，流速為5 mL·min^-1，進樣量200 μmL，柱溫為25 ℃，檢測波長210 nm，得到化合物5（40 mg，tR 19.5 min），6（30 mg，t_R 21.2 min）；Fr.8經(jīng)硅膠柱色譜，三氯甲烷-甲醇（20∶1）洗脫得到化合物7（80 mg）。

正丁醇部分采用硅膠柱色譜，用三氯甲烷-甲醇系統(tǒng)（100∶7～10∶1）洗脫得到Fr.1～ Fr.4。Fr.1經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜，甲醇洗脫，分為Fr.1-1和Fr.1-2。Fr.1-1用甲醇重結(jié)晶得化合物8（30 mg），F(xiàn)r.1-2裝入Amberchrom CG161M樹脂柱，用水，30%，60%，90%甲醇洗脫，30%甲醇洗脫部分得到化合物10（40 mg），60%甲醇洗脫部分得化合物9（60 mg）；Fr.2采用硅膠柱色譜，經(jīng)三氯甲烷-甲醇（20∶1）洗脫后分為Fr.2-1，F(xiàn)r.2-2和Fr.2-3，F(xiàn)r.2-2繼續(xù)用Sephadex LH-20柱色譜，甲醇洗脫，得化合物11（60 mg）。

2.2 補體經(jīng)典途徑的溶血活性（CH₅₀）測定[4]

2.2.1 溶液配制 巴比妥緩沖液（BBS），包含0.5 mol·L^-1鎂（Mg2+）和0.15 mol·L^-1鈣（Ca2+）。按實驗需要用巴比妥緩沖液配制成1∶1 000溶液，作為溶血素。

2.2.2 補體的效價測定 取一定量豚鼠血清（補體）配成1∶10溶液，并對倍稀釋成1∶20，1∶40，1∶80，1∶160。取溶血素、各溶度補體及2% SRBC各0.1 mL溶于0.3 mL BBS中，混勻，37 ℃水浴溫育30 min，離心后取上清液在405 nm處測定吸光度。以三蒸水溶血管的吸光度作為全溶血標(biāo)準(zhǔn)，選擇達到相似吸光度的最低補體溶度作為正常溶血所需的臨界補體溶度。

2.2.3 藥物經(jīng)典途徑抗補體活性測定 取臨界濃度的補體分別與不同濃度的供試品混勻，加入適量的BBS、溶血素和2% SRBC。37 ℃水浴溫育30 min，離心后取上清液在405 nm處測定吸光度。實驗同時設(shè)置對照組和全溶血組。以供試品濃度作為X，以供試品組扣除對照組吸光度計算溶血抑制率作為Y，計算CH₅₀。

3 結(jié)果

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 白色針晶（氯仿）；與文獻[5]報道豆甾醇的數(shù)據(jù)一致。

化合物2 白色無定形粉末；¹H-NMR（CDCl₃，400 MHz）δ： 5.35（1H，m，H-11），3.52（1H，m，H-3），0.68（3H，s，H-18），1.00（3H，s，H-19），0.82（3H，d，J=6.0 Hz，H-21），0.89（3H，d，J=6.0 Hz，H-26），0.85（3H，d，J=6.0 Hz，H-29）； ¹³C-NMR（CDCl₃，100 MHz）δ： 31.8（C-1），32.1（C-2），72.0（C-3），39.9（C-4），42.6（C-5），24.5（C-6），28.4（C-7），37.4（C-8），140.9（C-9），36.7（C-10），121.9（C-11），42.5（C-12），46.0（C-13），56.2（C-14），23.2（C-15），21.2（C-16），56.9（C-17），12.1（C-18），18.9（C-19），36.3（C-20），19.2（C-21），34.1（C-22），29.9（C-23），50.3（C-24），29.3（C-25），20.0（C-26），19.6（C-27），26.2（C-28），12.0（C-29）。以上數(shù)據(jù)與文獻[6]報道豆甾醇-9（11）-烯-3-醇的數(shù)據(jù)一致。

化合物3 白色針晶（三氯甲烷）；¹H-NMR（CDCl₃，300 MHz）δ： 5.45（1H，s，H-17a），6.18（1H，s，H-17b），5.42（1H，dd，J=11.6，4.4 Hz，H-7），4.83（1H，s，H-14），1.14（3H，s，H-18），1.06（3H，s，H-19），1.07（3H，s，H-20）； ¹³C-NMR（CDCl₃，75 MHz）δ： 38.1（C-1），33.5（C-2），216.6（C-3），46.7（C-4），51.0（C-5），26.5（C-6），74.2（C-7），61.1（C-8），53.3（C-9），38.9（C-10），18.6（C-11），30.8（C-12），45.7（C-13），75.7（C-14），204.7（C-15），146.6（C-16），118.7（C-17），28.0（C-18），20.8（C-19），18.1（C-20），168.3（-CO），21.3（-CH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻[7]報道藍萼丁素的數(shù)據(jù)一致。

化合物4 白色針晶（甲醇）；m/z 389 [M+K]+； ¹H-NMR（DMSO-d₆，400 MHz）δ： 3.51（1H，d，J=9.4 Hz，H-1），1.71（1H，m，H-2），5.33（1H，s，H-17a），6.04（1H，s，H-17b），0.86（3H，s，H-18），0.85（3H，s，H-19），4.06（1H，d，J=12.0 Hz，H-20a），3.85（1H，d，J=12.0 Hz，H-20b）； ¹³C-NMR（DMSO-d₆，100 MHz）δ： 80.5（C-1），29.7（C-2），38.6（C-3），32.5（C-4），51.3（C-5），29.3（C-6），73.7（C-7），60.6（C-8），55.7（C-9），46.2（C-10），20.2（C-11），30.5（C-12），46.4（C-13），75.1（C-14），208.4（C-15），149.5（C-16），115.4（C-17），33.2（C-18），22.0（C-19），60.5（C-20）。以上數(shù)據(jù)與文獻[8]報道尾葉香茶菜甲素的數(shù)據(jù)一致。

化合物5 白色無定形粉末；¹H-NMR（DMSO-d₆，400 MHz）δ： 1.08（3H，s，H-23），0.92（3H，s，H-24），0.82（3H，s，H-25），0.92（3H，s，H-26），0.92（3H，s，H-27），0.71（3H，s，H-29），0.75（3H，s，H-30），4.30（1H，s，H-2），5.17（1H，br s，H-12）； ¹³C-NMR（DMSO-d₆，100 MHz ）δ： 45.7（C-1），67.1（C-2），82.2（C-3），38.9（C-4），54.8（C-5），18.1（C-6），32.9（C-7），46.8（C-8），47.1（C-9），37.7（C-10），23.4（C-11），121.4（C-12），143.9（C-13），41.3（C-14），27.2（C-15），22.6（C-16），45.4（C-17），23.0（C-18），40.8（C-19），30.4（C-20），33.3（C-21），32.3（C-22），28.8（C-23），16.3（C-24），16.9（C-25），17.1（C-26），25.7（C-27），178.6（C-28），32.8（C-29），22.9（C-30）。以上數(shù)據(jù)與文獻[9]報道山楂酸的數(shù)據(jù)一致。

化合物6 白色無定形粉末；¹H-NMR（DMSO-d₆，400 MHz）δ： 1.04（3H，s，H-23），0.80（3H，s，H-24），0.91（9H，s，H-25～27），0.72（3H，d，J=6.3 Hz，H-29），0.72（3H，d，J=6.3 Hz，H-30），4.37（1H，s，H-2），5.13（1H，br s，H-12），2.73（1H，d，J=9.2 Hz，H-19）； ¹³C-NMR（DMSO-d₆，100 MHz）δ： 46.8（C-1），67.1（C-2），82.2（C-3），37.6（C-4），54.7（C-5），18.0（C-6），32.6（C-7），41.7（C-8），47.1（C-9），37.5（C-10），23.0（C-11），124.5（C-12），138.3（C-13），41.7（C-14），27.5（C-15），23.8（C-16），47.0（C-17），52.4（C-18），38.5（C-19），38.5（C-20），30.2（C-21），36.3（C-22），28.8（C-23），17.2（C-24），16.5（C-25），17.0（C-26），23.3（C-27），178.3（C-28），21.1（C-29），17.0（C-30）。以上數(shù)據(jù)與文獻[10]報道科羅索酸的數(shù)據(jù)一致。

化合物7 白色晶體（甲醇）；¹H-NMR（DMSO-d₆，400 MHz）δ： 1.00（3H，d，J=6.9 Hz，H-17），0.99（3H，s，H-18），0.75（3H，s，H-19），0.97（3H，s，H-20）；¹³C-NMR（DMSO-d₆，100 MHz）δ： 36.9（C-1），24.3（C-2），83.5（C-3），38.5（C-4），52.4（C-5），28.7（C-6），73.5（C-7），59.7（C-8），54.0（C-9），37.6（C-10），16.7（C-11），22.9（C-12），41.8（C-13），74.4（C-14），220.8（C-15），42.3（C-16），9.2（C-17），28.2（C-18），17.6（C-19），17.1（C-20），100.8（C-1′），73.9（C-2′），76.6（C-3′），70.1（C-4′），76.8（C-5′），61.3（C-6′）。以上數(shù)據(jù)與文獻[11]報道m(xù)inheryins I的數(shù)據(jù)一致。

化合物8 淡黃色粉末；¹H-NMR（DMSO-d₆，300 MHz）δ： 3.87（3H，s，4′-OCH3），6.89（1H，d，J=8.1 Hz，H-5′），7.42（1H，d，J=1.9 Hz，H-2′），7.45（1H，dd，J=8.1，1.9 Hz，H-6′），6.37（1H，s，H-3），6.71（1H，d，J=2.0 Hz，H-6），6.72（1H，d，J=2.0 Hz，H-8），9～10（2H，br s，3′，7-OH），12.97（1H，s，5-OH）； ¹³C-NMR（DMSO-d₆，75 MHz）δ： 165.1（C-2），104.7（C-3），181.8（C-4），157.2（C-5），97.9（C-6），164.2（C-7），92.5（C-8），161.2（C-9），103.0（C-10），119.1（C-1′），113.5（C-2′），149.8（C-3′），145.8（C-4′），116.0（C-5′），121.4（C-6′），56.0（4′-OCH3）。以上數(shù)據(jù)文獻[12]報道香葉木素的數(shù)據(jù)一致。

化合物9 淡黃色粉末；¹H-NMR（DMSO-d₆，400 MHz）δ： 7.10（1H，d，J=2.0 Hz，H-2），6.78（1H，d，J=8.2 Hz，H-5），6.97（1H，dd，J=2.0，8.2 Hz，H-6），7.63（1H，d，J=15.9 Hz，H-7），6.34（1H，d，J=15.9 Hz，H-8），7.34（1H，dd，J=6.3，14.0 Hz，H-10），4.97（1H，d，J=14.0 Hz，H-11a），4.69（1H，d，J=6.3 Hz，H-11b）； ¹³C-NMR（DMSO-d₆，100 MHz）δ： 125.3（C-1），115.1（C-2），145.6（C-3），149.0（C-4），115.8（C-5），121.9（C-6），147.4（C-7），112.1（C-8），163.8（C-9），141.4（C-10），97.9（C-11）。以上數(shù)據(jù)與文獻[13]報道咖啡酸乙烯酯的數(shù)據(jù)一致。

化合物10 淡黃色粉末；IR（KBr，cm^-1）v： 3 500，2 500提示有（-COOH），（-OH），1 500～1 600為（-Ar）； ¹H-NMR（DMSO-d₆，300 MHz）δ： 7.42（1H，d，J=15.9 Hz，H-7），6.17（1H，d，J=15.9 Hz，H-8），7.03（1H，s，H-2），6.76（1H，d，J=8.1 Hz，H-5），6.97（1H，d，J=8.1 Hz，H-6）； ¹³C-NMR（DMSO-d₆，75 MHz）δ： 125.9（C-1），114.8（C-2），145.7（C-3），148.3（C-4），115.3（C-5），121.3（C-6），144.7（C-7），115.9（C-8），168.0（C-9）。以上數(shù)據(jù)與文獻[14]報道咖啡酸的數(shù)據(jù)一致。

化合物11 黃色粉末；¹H-NMR（DMSO-d₆，400 MHz）δ： 13.18（1H，s，5-OH），8.03（2H，d，J=8.7 Hz，H-2′，6′），6.89（2H，d，J=8.8 Hz，H-3′，5′），6.79（1H，s，H-3），6.28（1H，s，H-6），4.68（1H，d，J=9.9 Hz，H-1″）。¹³C-NMR（DMSO-d₆，100 MHz）δ： 164.0（C-2），102.4（C-3），182.1（C-4），160.4（C-5），98.1（C-6），162.5（C-7），104.1（C-8），156.0（C-9），104.6（C-10），121.6（C-1′），129.0（C-2′，6′），115.8（C-3′，5′），161.1（C-4′），78.7（C-1″），73.4（C-2″），70.8（C-3″），70.6（C-4″），81.9（C-5″），61.3（C-6″）。以上數(shù)據(jù)與文獻[15]報道牡荊苷的數(shù)據(jù)一致。

3.2 單體化合物的50%抑制溶血濃度

5批次不同稀釋倍數(shù)豚鼠血清（補體）加入溶血體系中，評價其效價。在補體稀釋溶度為1∶10～1∶80時，溶血率接近100%，體系基本達到全溶血，所以選擇1∶80稀釋的豚鼠血清作為經(jīng)典途徑篩選實驗中所使用的補體濃度，將從香茶菜中得到的16個化合物進行體外抗補體活性測試，其中咖啡酸的活性最強，見表1。