2型糖尿病合并腎病與PPAR基因相關(guān)性研究

應(yīng)衛(wèi)嬋 霍曉靜

2型糖尿病合并腎病與PPAR基因相關(guān)性研究

應(yīng)衛(wèi)嬋 霍曉靜

目的 探討2型糖尿?。═2DM）及糖尿病腎?。―N）與過氧化物酶體增殖物受體γ（PPARγ）基因P12A位點(diǎn)多態(tài)性的關(guān)系。 方法 選擇DM患者（無并發(fā)癥者100例），DN患者95例；正常對(duì)照（CN）組100例。應(yīng)用RFLPPCR技術(shù)檢測(cè)PPARγP12A位點(diǎn)多態(tài)性，比較組間基因型、等位基因頻率及臨床變量間的差異。 結(jié)果 （1）DM組及DN組P12A12基因及A12等位基因頻率均明顯低于CN組（P＜0.05）；DM組與DN組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（2）攜帶PA基因型的糖尿病患者24h尿蛋白定量、血β2微球蛋白均低于P12P12基因攜帶者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。 結(jié)論 PPARγ基因P12A位點(diǎn)多態(tài)性與DM及DN發(fā)病相關(guān)，A12等位基因可能是DN的保護(hù)因素。

2型糖尿病 糖尿病腎病 過氧化物酶體增殖物受體γ 多態(tài)性 限制性片段長(zhǎng)度

近年來大量研究發(fā)現(xiàn)過氧化物酶體增殖物受體γ基因P12A位點(diǎn)（PPARγP12A）基因突變與糖脂代謝、2型糖尿?。═2DM）等疾病都有一定的相關(guān)性。糖尿病腎?。―N）是DM主要并發(fā)癥及主要死因之一，其發(fā)病基礎(chǔ)是胰島素的抵抗。PPARγP12A基因攜帶者體內(nèi)胰島素敏感度升高，可能與DN的發(fā)病存在著一定聯(lián)系。為此本研究選擇PPARγP12A基因作為靶基因，旨在探討PPARγP12A基因多態(tài)性與DM、DN是否相關(guān)。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取金華市人民醫(yī)院2010-2012年就診的T2DM患者，包括單純DM組100例，年齡32～76歲，平均（57.50±10.90）歲；DN組95例，年齡26～79歲，平均（58.33±9.40）歲；健康對(duì)照（CN）組100例，年齡35～61歲，平均（52.13±9.46）歲。CN組為健康體檢者，無T2DM、腎病病史、家族史。各組間年齡、性別相匹配（表1）。所有受試者均排除嚴(yán)重肝、腎疾病及自身免疫性疾病。所有受試對(duì)象均簽署知情同意書，自愿參與本課題研究，本研究經(jīng)金華市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)同意。

T2DM診斷符合1999年WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)；DN診斷依據(jù)《內(nèi)科學(xué)》第7版。DN患者入選標(biāo)準(zhǔn)為尿蛋白測(cè)定＞300mg/24h。

1.2 方法

1.2.1 一般資料的收集 專人記錄及測(cè)定研究對(duì)象的一般資料，包括年齡、性別、身高、體重、血壓等指標(biāo)。

1.2.2 臨床生化指標(biāo)檢測(cè) 所有對(duì)象于空腹10～14h后于清晨7～8點(diǎn)，采取肘靜脈血5ml，用EDTA抗凝。用于肝功能檢查、FPG、TC、TG、HDL-C、LDL-C及HbA1c、Cr、UAC、β2-MG等化驗(yàn)指標(biāo)。留取24h尿，化學(xué)比濁法測(cè)定24h蛋白定量等指標(biāo)。

1.2.3 PPARγP12A基因多態(tài)性的測(cè)定 PCR檢測(cè)：反應(yīng)引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成，引物序列：上游5′5′-CAAGCCCAGTCCTTTCTGTG-3；下游5′-AGTGAAGGAATCGCTTTCCG-3′。PCR反應(yīng)體系（25μl）：10×PCR緩沖液2.5μl，MgCl22.5μl，dNTP（10mM）0.35μl，上下游引物（10μM）各1.25μl，TaqDNA聚合酶1U，模板DNA3μl，純水16.4μl。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性93°C 2min，變性94°C 30s，退火55°C 50s，延伸72°C 60s，終末延伸限72°C 5min。于1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（restriction fragment length polymorphism,RFLP）：PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶HpaⅡ酶切37°C 4h。置于2%的瓊脂糖凝膠電泳確定基因型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料采用表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)；采用χ2檢驗(yàn)分析各組間基因型、等位基因頻率分布。

2 結(jié)果

2.1 3組間臨床資料比較 見表1。

表1 3組臨床指標(biāo)的比較

由表1可見，DM組和DN組FPG、HbA1c均高于CN組（均P＜0.05），而年齡、性別、BMI、TG、TC、LDL-C、HDL-C差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），DN組與DM組相比，兩組間年齡、性別、BMI、FBG、HbA1c、TG、TC、LDL-C、HDL-C差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），但DN組的病程明顯長(zhǎng)于DM組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.2 PPAR基因頻率分布 本研究在所有受試對(duì)象中共檢出兩種基因型PP型與PA型，未檢出AA基因型。各組PPARγP12A基因頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律，證實(shí)本實(shí)驗(yàn)樣本具有群體代表性。詳見表2。

表2 PPARγP12A基因型、等位基因分布頻率（例）

由表2可見，DM組的PA基因型（χ2=10.125，P=0.001，OR=0.303，95%CI：0.141～0.648）以及A12等位基因（χ2=9.0，P=0.003，OR=0.343，95%CI：0.166～0.708）頻率明顯低于CN組，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；DN組PA基因型（χ2=4.043，P=0.044，OR=0.483，95%CI：0.236～0.989）以及A12等位基因（χ2=5.052，P=0.025，OR=0.469，95%CI：0.24～0.918）頻率明顯低于CN組，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。DM組與DN組之間PA基因型（χ2=1.177，P=0.278）以及A12等位基因（χ2=0.567，P=0.451）頻率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）。

2.3 PM患者P12P12和P12A12基因型間臨床資料比較 見表3。

表3 不同基因型間臨床資料的比較

由表3可見，PP基因攜帶者24h尿蛋白定量、β2-MG均顯著高于PA基因攜帶者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。兩者間BMI、FBG、血脂、UAC、HbA1c、Cr差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

3 討論

PPARγ屬于核激素受體超家族的一員,它與脂肪細(xì)胞分化、糖脂代謝、胰島素敏感性均有密切的關(guān)系。因此近年來PPARγ與T2DM及其并發(fā)癥是否相關(guān)成為人們研究的熱點(diǎn)問題。PPARγ基因主要包含9個(gè)外顯子，人類染色體編碼3種PPARγ基因，分別對(duì)應(yīng)3種PPAR-γmRNA，產(chǎn)生γ1、γ2、γ3三種蛋白產(chǎn)物。PPARγ2主要在脂肪組織中表達(dá)。其外顯子B編碼的28個(gè)氨基酸是決定PPARγ2功能活性的主要結(jié)構(gòu)單位。在PPARγ2外顯子B的第12位密碼子中存在CCA-GCA多態(tài)性，造成脯氨酸-丙氨酸的替換。有研究顯示此一替換（即X/A基因型）會(huì)通過直接影響PPARγ的活性而改變血糖的穩(wěn)態(tài)以及脂質(zhì)分化的通路[1]。由此有學(xué)者推測(cè)PPARγ2多態(tài)性可能與T2DM及其并發(fā)癥的發(fā)生相關(guān)。

PPARγ2基因多態(tài)性有3種基因型，包括PA、AA、PP，但純合子AA突變率很低，本實(shí)驗(yàn)未檢出AA基因型。故僅對(duì)PA和PP基因型進(jìn)行分析。近年大量研究認(rèn)為，PA基因型可能與改善DN癥狀有關(guān)系。一些研究顯示了PPARγ2基因Ala變異對(duì)于降低DM及DN的發(fā)病率有著顯著的效果[2]。另有一些研究也發(fā)現(xiàn)，Ala變異對(duì)于DN并沒有直接的相關(guān)性，但P12A基因的多態(tài)性與脂肪代謝和降低肥胖的發(fā)生率密切關(guān)系[3-4]。由上述研究可以發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)于P12A基因多態(tài)性對(duì)DN的影響結(jié)果不盡相同。由此可見，它與DN及DM病相關(guān)性存在著明顯的種族和地區(qū)差異性。

我們的研究發(fā)現(xiàn)DM組P12A12基因型和A12等位基因頻率明顯低于CN組，推測(cè)A12基因變異在DM的發(fā)生中起到了保護(hù)作用，然而研究發(fā)現(xiàn)CN組與非腎病組間基因頻率分布未顯現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，原因可能與與本研究樣本量較少有關(guān)，有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量來證實(shí)。我們對(duì)不同基因型的DM患者進(jìn)行分組比較發(fā)現(xiàn)，PA基因型患者的24h尿蛋白明顯低于PP基因型，推測(cè)A12等位基因攜帶者尿蛋白排泌量減少，延緩了腎血管病變的過程，在DN的發(fā)展中可能起到了保護(hù)作用。作為胰島素增敏劑的噻唑烷二酮類藥物是通過作用于過氧化物酶體增殖物受體發(fā)揮對(duì)DM的治療作用，因此我們認(rèn)為該類藥物對(duì)于預(yù)防DN的發(fā)生、發(fā)展也同樣有著積極的作用，有待于我們進(jìn)一步深入的研究。

[1] Jifeng Z,Mingui F,Taixing C,et al.Selective disruption of PPAR 2 impairs the development of adipose tissue and insulin sensitivity[J].PNAS,2004,101:10703-10708.

[2] Stefan M H,Jens R,Ji-Guang W,et al.Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-γ2 Polymorphism Pro12Ala Is Associated With Nephropathy in Type 2 Diabetes:The Berlin Diabetes Mellitus(BeDiaM)Study[J].Diabetes,2002,51(8):2653-2657．

[3] Bouassida K Z,Chouchane L,Jellouli K,et al．The peroxisome proliferator activated receptorφ2 (PPARφ2)Pro12Ala variant: lack of association with type 2 diabetes in obese and non obese Tunisian patients[J].Diabetes Metabolism,2005,31(2):119-123．

[4] Badii R,Bener A,Zirie M,et al.Lack of association between the Pro12Ala polymorphism of the PPARγ2 gene and type 2 diabetes mellitus in the Qatari consanguineous population[J].Acta Diabetologica,2008,45(1):15-21．

PPAR gene polymorphism in diabetic nephropathy

Type 2 diabetes mellitus Diabetic nephropathy PPARγ Polymorphism Restriction fragment length

2012-03-20）

（本文編輯：沈昱平）

金華市科技衛(wèi)生項(xiàng)目（2011-3-041）

321000 金華市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科（應(yīng)衛(wèi)嬋）；蘭溪市人民醫(yī)院（霍曉靜）

應(yīng)衛(wèi)嬋，E-mail：jhywc@163.com

【 Abstract】Objective To investigate the relationship between the PPAR-γ2 Pro12Ala polymorphism and diabetic nephropathy. Methods The PPAR-γ2Pro12Ala polymorphism was determined by PCR-RFLP in 95 patients with diabetic nephropathy(DN),100 type 2 diabetic patients without complications(DM2)and 100 normal controls(CN).Results The frequency of Pro12Ala mutation was significantly higher in DM2 and DN groups than that in CN group(P＜0.05).The 24h-urinary protein and serum β2 microglobulin levels in DM2 patients with PA genotype were lower than those with PP genotype (both P＜0.05). Conclusion PPAR γ gene P12A polymorphism may be associated with type 2 diabetes and diabetic nephropathy,the A12 allele may be a protective factors for diabetic nephropathy.