慢病毒介導(dǎo)的hGM-CSF修飾的腫瘤疫苗免疫活性研究

林阿麗 孫青

慢病毒介導(dǎo)的hGM-CSF修飾的腫瘤疫苗免疫活性研究

林阿麗 孫青

目的 構(gòu)建編碼人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（human granulocyte-macrophage colony stimulating factor，hGM-CSF）的慢病毒載體，研究編碼hGM-CSF的慢病毒載體對樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）疫苗抗腫瘤活性的增強作用。方法以質(zhì)粒pORFhGM-CSF為模板，采用PCR方法擴(kuò)增出hGM-CSF基因片段；通過BamHⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶位點，將hGM-CSF基因定向克隆到慢病毒連接載體L166中構(gòu)建重組載體L166-hGM-CSF。將重組載體L166-hGM-CSF和包裝載體L205以及包膜載體L311共同轉(zhuǎn)染慢病毒包裝細(xì)胞293T，72h后收集病毒上清液獲得編碼hGM-CSF的慢病毒顆粒LentihGM-CSF。從臍血中分離出單核細(xì)胞，rhGM-CSF、rhIL-4和α-TNF誘導(dǎo)獲得DC，通過相差顯微鏡和流式細(xì)胞儀鑒定。應(yīng)用反復(fù)凍融法制備可溶性腫瘤抗原，分別將負(fù)載腫瘤抗原的DC疫苗和慢病毒Lenti-hGM-CSF感染的負(fù)載腫瘤抗原的DC疫苗與T淋巴細(xì)胞共同培養(yǎng)，MTT方法檢測并比較兩者所誘導(dǎo)的CTL對反應(yīng)細(xì)胞的體外殺傷活性。結(jié)果 編碼hGM-CSF的慢病毒載體L166-hGM-CSF成功構(gòu)建，獲得了編碼hGM-CSF的慢病毒。該慢病毒的Hela細(xì)胞上清液中hGM-CSF的表達(dá)明顯高于未感染者。從臍血中分離出的DC，顯示其高表達(dá)CD80（87．2%）和CD86（92．8%），而單核細(xì)胞標(biāo)志CD14的表達(dá)率較低（3．56%）。慢病毒介導(dǎo)的分泌hGM-CSF的樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗刺激同種T淋巴細(xì)胞增殖的能力和抗腫瘤活性較普通DC疫苗明顯增強（P＜0．01）。結(jié)論本實驗制備的慢病毒Lenti-hGM-CSF感染反應(yīng)細(xì)胞后能夠顯著增強DC腫瘤疫苗刺激同種T淋巴細(xì)胞增殖的能力及其誘導(dǎo)的CTL細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力，為hGM-CSF修飾的DC腫瘤疫苗的臨床應(yīng)用提供了一定的實驗依據(jù)。

慢病毒載體 粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子 樹突狀細(xì)胞 腫瘤疫苗

樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）是已知的功能最強的抗原遞呈細(xì)胞，也是惟一能夠激發(fā)機體初始免疫反應(yīng)的抗原遞呈細(xì)胞。DC可攝取腫瘤抗原，發(fā)育成熟后在膜上高表達(dá)MHCⅠ、Ⅱ類分子，并遞呈大量的腫瘤抗原給T細(xì)胞受體；同時也可提高協(xié)同刺激分子B7-1、B7-2和CD40等的表達(dá)，并使T細(xì)胞被激活；而且DC與T細(xì)胞結(jié)合后可分泌大量的IL-12，IL-12強有力地誘導(dǎo)T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NK）和淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞（LAK），產(chǎn)生大量TNF-γ、穿孔素和顆粒酶，增強細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）和NK對反應(yīng)細(xì)胞的溶解作用。動物實驗、體外實驗和早期臨床試驗表明，通過載體將腫瘤抗原、細(xì)胞因子佐劑或共刺激因子等轉(zhuǎn)入DC制備的DC疫苗，有較強的抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用[1-4]。人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（human granulocyte macrophage colony stimulating factor,hGM-CSF）具有多種生物活性，可促進(jìn)DC等抗原遞呈細(xì)胞的分化、成熟和活化；增加DC表面的主要組織相容復(fù)合物Ⅱ，促進(jìn)腫瘤抗原的有效遞呈；同時還可增強外周血單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)、抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒效應(yīng)等，從而誘導(dǎo)有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答。hGM-CSF已被廣泛應(yīng)用到腫瘤疫苗的研究中，并取得了一定成效。本研究擬構(gòu)建編碼hGM-CSF的慢病毒載體，經(jīng)修飾后感染負(fù)載腫瘤抗原的DC細(xì)胞制備腫瘤疫苗，研究其抗腫瘤細(xì)胞活性，旨在為腫瘤的生物治療開辟新的途徑。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 載體及細(xì)胞系 本研究使用的載體L166、L205、L311和pORFhGM-CSF由美國Alabama大學(xué)血液學(xué)與腫瘤學(xué)實驗室惠贈；作為慢病毒的包裝細(xì)胞的293T細(xì)胞系由美國Alabama大學(xué)血液學(xué)與腫瘤學(xué)實驗室惠贈；Hela細(xì)胞由山東省千佛山醫(yī)院病理科實驗室提供，采用1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）及嘌呤霉素產(chǎn)自美國Gibco公司；胎牛血清產(chǎn)自杭州四季青公司；BamHⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶及T4連接酶產(chǎn)自美國Promega公司；重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、rhIL-4、α-TNF、rhIL-2、FITC標(biāo)記的CD14、CD80和CD86產(chǎn)自深圳晶美公司；淋巴細(xì)胞分離液產(chǎn)自天津TBD公司；質(zhì)粒提取試劑盒Endo-free kit Maxi產(chǎn)自德國Qiagen公司；膠回收試劑盒E.Z.N.A.Gel Extraction Kit產(chǎn)自美國Omega公司；ELISA檢測試劑盒Human GM-CSF DuoSet kit產(chǎn)自美國R&B公司。

1.2 方法

1.2.1 編碼hGM-CSF的慢病毒載體的構(gòu)建 （1）hGM-CSF基因全長的PCR擴(kuò)增，根據(jù)Invivogen公司提供的質(zhì)粒pORFhGM-CSF的基因序列，設(shè)計一對特異性引物，上游引物hGM-CSF 1：BamHⅠ5′-GCGGATCCATGTGGCTGCAGAGCCTGCT-3′，下游引物hGM-CSF 2：XhoⅠ 5′-GCCTCGAGTGACTCCTGGACTGGCTCC-3′，同時分別在5′端設(shè)計上BamHⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶位點，委托上海生物工程技術(shù)有限公司合成。以pORFhGM-CSF為模板，PCR擴(kuò)增hGM-CSF基因。PCR產(chǎn)物長度為489bp。（2）重組載體L166-hGM-CSF的構(gòu)建：將純化回收的hGM-CSF目的基因插入到載體L166的BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點之間。用氨芐青霉素篩選陽性重組載體，用Endo-free kit Maxi試劑盒大量提取載體。（3）編碼hGM-CSF慢病毒的包裝：將重組載體L166-hGM-CSF、包裝載體L205及包膜載體L311共同轉(zhuǎn)染至包裝細(xì)胞293T內(nèi)，次日換普通的DMEM培養(yǎng)基，5d后收集漂浮層，3 000r/min離心20min。將上清液用0.45μm的濾膜負(fù)壓過濾，收集編碼hGM-CSF的慢病毒，即為慢病毒Lenti-hGM-CSF[5]。

1.2.2 宮頸癌抗原的制備 收集對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞裝入凍存管，將凍存管浸入液氮中凍存，10min后取出，迅速置37℃，待其完全融化后，再次放入液氮中，如此反復(fù)5次。將腫瘤細(xì)胞裂解物加入離心管，2 000r/min離心20min，收集上清液，經(jīng)0.45μm無菌濾膜過濾，紫外分光光度儀檢測抗原濃度。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 DC的體外誘導(dǎo)與培養(yǎng) 無菌抽取新鮮的健康新生兒臍血（山東省千佛山醫(yī)院婦產(chǎn)科分娩的健康新生兒），經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液梯度離心，收集單個核細(xì)胞，置培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入含10%FBS的PRMI1640培養(yǎng)液37℃5%CO2培養(yǎng)2h，除去非貼壁細(xì)胞，加入PRMI1640培養(yǎng)液（10%FBS+50ng/ml rhGM-CSF+100ng/ml rhIL-4）常規(guī)培養(yǎng)，3d后半量補加培養(yǎng)液。第7天加入10ng/ml的α-TNF，繼續(xù)培養(yǎng)24h，次日收集懸浮細(xì)胞即得活化的DC細(xì)胞（DC組）。

1.2.4 凍融抗原沖擊DC 收集培養(yǎng)第6天的DC細(xì)胞用含RPMI1640培養(yǎng)液（10%FBS+50ng/ml rhGM-CSF+ 100ng/ml rhIL-4）制成細(xì)胞懸液，接種于2個60mm培養(yǎng)皿,分別加入制備的宮頸癌抗原（100μg/ml）培養(yǎng)過夜。次日加入α-TNF（10ng/ml）繼續(xù)培養(yǎng)24h即得到活化的宮頸癌DC疫苗（DC/H組）。其中一培養(yǎng)皿在加入宮頸癌抗原的同時加入200μl慢病毒Lenti-hGM-CSF進(jìn)行感染，得到的DC疫苗為Lenti-DC/H組。

1.2.5 測定慢病毒轉(zhuǎn)染前后DC的hGM-CSF濃度 于DC誘導(dǎo)的第8天，分別收集DC組、DC/H組、Lenti-DC/ H組3組細(xì)胞的培養(yǎng)液10μl，用ELISA試劑盒檢測慢病毒轉(zhuǎn)染前后DC培養(yǎng)液上清液中OD450的變化。通過回歸分析得出計算公式：濃度（pg/ml）=（OD450值-0.2883）/ 0.0029，將各標(biāo)本的OD450值同其比較，獲得3組的hGM-CSF濃度。

1.2.6 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的測定 DC用RPMI-1640完全培養(yǎng)基懸浮，調(diào)整密度為1×106/ml，加入絲裂霉素25μg/ml，37℃孵育30min。DC及T細(xì)胞用完全RPMI1640培養(yǎng)基重懸。按照刺激細(xì)胞和反應(yīng)細(xì)胞之比分別為1∶10、1∶100、1∶1 000的比例將DC細(xì)胞加入96孔培養(yǎng)板。每組各設(shè)6個復(fù)孔，每孔100μl。同時設(shè)T細(xì)胞對照組和空白對照組。37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h，取出后每孔加入MTT 10μl（5mg/ml），37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h。每孔吸棄上清液100μl，再加入100μl鹽酸異丙醇，避光保存10min，于492nm處用酶標(biāo)儀測量OD值，結(jié)果用6孔均值表示。根據(jù)下述公式：DC刺激淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)（SI）=（實驗組OD值-空白對照組OD值）/（T細(xì)胞對照組OD值-空白對照組OD值）。

1.2.7 腫瘤特異性CTL對反應(yīng)細(xì)胞的殺傷能力的測定于DC培養(yǎng)的第7天收集處于對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞濃度為1×104/ml，每孔100μl接種于96孔板，37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。次日收集DC、Lenti-DC/H和DC/H細(xì)胞，按照效靶比為20∶1、10∶1和5∶1接種96孔板。同時設(shè)T細(xì)胞對照組。每組均設(shè)6個復(fù)孔。37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，每孔加入10μl MTT（5mg/ ml），繼續(xù)培養(yǎng)4h，每孔吸棄100μl上清液，加入100μl鹽酸異丙醇溶液，避光保存10min后，于492nm處用酶標(biāo)儀測量OD值，結(jié)果用3孔均值表示。根據(jù)以下公式計算抑瘤率：抑瘤率（%）=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，組間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 重組慢病毒載體L166-hGM-CSF的鑒定 篩選陽性重組載體L166-hGM-CSF，快速小量提取載體DNA，經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后，得到兩條明亮清晰的條帶，一條為hGM-CSF片段（約14 000bp），另一條與hGM-CSF片段大小一致（434bp），見圖1。

2.2 DC的體外培養(yǎng)與鑒定 從臍血中獲得的單個核細(xì)胞經(jīng)貼壁培養(yǎng)2h后，獲得黏附細(xì)胞，加入rhGM-CSF（100ng/ml）和rhIL-4（50ng/ml）培養(yǎng)48h后細(xì)胞出現(xiàn)不規(guī)則形態(tài)，同時懸浮細(xì)胞增多，以后隨著時間的延長，懸浮細(xì)胞逐漸增多，細(xì)胞周邊可見突起。第5天時細(xì)胞均勻分布在培養(yǎng)液中，細(xì)胞體積較大，部分細(xì)胞出現(xiàn)樹突狀突起（圖2）。經(jīng)腫瘤抗原沖擊后的DC體積變大，細(xì)胞突起更加明顯。慢病毒轉(zhuǎn)染后的DC細(xì)胞在形態(tài)上未見明顯變化。收集誘導(dǎo)第7天的成熟DC細(xì)胞進(jìn)行流式檢測，結(jié)果顯示DC細(xì)胞表面CD14、CD80和CD86的表達(dá)率分別為3.56%、87.2%和92.8%，單核細(xì)胞特異性標(biāo)志CD14已基本丟失，說明成功誘導(dǎo)出DC。DC表型CD14、CD80、CD86流式圖見圖3。

圖1 限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切重組載體L166-hGMCSF電泳結(jié)果（M：D2000 Marker；1：hGM-CSF片段）

圖2 從人臍帶血分離培養(yǎng)至第5天的DC細(xì)胞

2.3 慢病毒轉(zhuǎn)染前后DC分泌hGM-CSF的變化 A、B、C 3組hGM-CSF濃度分別為92、93和213ng/ml。C組DC培養(yǎng)液中hGM-CSF含量高于未經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染的A組和B組。

2.4 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng) 經(jīng)腫瘤抗原沖擊后的DC刺激淋巴細(xì)胞增殖的能力優(yōu)于未負(fù)載腫瘤抗原的DC，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。經(jīng)慢病毒感染后DC細(xì)胞刺激淋巴細(xì)胞增殖的能力有了明顯的增加（P＜0.05或0.01），SI均＞1.5。具體結(jié)果見表1。

2.5 腫瘤特異性CTL對反應(yīng)細(xì)胞的殺傷能力 經(jīng)腫瘤抗原沖擊的DC所誘導(dǎo)的CTL對腫瘤細(xì)胞的殺傷效力高于未經(jīng)抗原沖擊的一組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。而經(jīng)編碼hGM-CSF的慢病毒感染后腫瘤抗原沖擊的DC所誘導(dǎo)的CTL對腫瘤細(xì)胞的抑制作用有了更顯著提高（P＜0.05或0.01）。具體結(jié)果見表2。

圖3 DC表型CD14、CD80、CD86流式圖（A：CD14，B：CD80，C：CD86）

表1 不同組別DC細(xì)胞刺激T細(xì)胞增殖能力

表2 慢病毒轉(zhuǎn)染前后DC疫苗對腫瘤細(xì)胞的體外殺傷能力

3 討論

GM-CSF是一種對細(xì)胞和體液免疫功能都具有廣泛調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子[6]。GM-CSF不僅可以刺激T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞的增殖和活化，從而增強宿主抗腫瘤免疫力，還可以刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α，直接調(diào)節(jié)宿主抗腫瘤活性[7-9]。Urdinguio等[10]研究發(fā)現(xiàn)，GMCSF過表達(dá)的結(jié)腸腫瘤患者其5年生存率高達(dá)100%。Songbing等[11]構(gòu)建了hHGM-CSF腺病毒載體，并以此轉(zhuǎn)染DC制備腫瘤疫苗，用以體外殺傷結(jié)腸癌CT26細(xì)胞，結(jié)果90%的腫瘤細(xì)胞被殺傷。

腫瘤疫苗的制備需借助一定的載體將目的基因轉(zhuǎn)移至反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)。非病毒學(xué)的基因轉(zhuǎn)移方法效率較低；已用于人體試驗的基因治療方案絕大多數(shù)是以病毒學(xué)方法進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移的，目前的細(xì)胞因子腫瘤疫苗大多采用復(fù)制缺陷型腺病毒做載體[4，6-7]，但hGM-CSF僅能短期表達(dá)，而且腺病毒本身某些抗原的表達(dá)也可引起人體免疫反應(yīng)，效果不甚理想。慢病毒載體是以Ⅰ型人免疫缺陷病毒為基礎(chǔ)構(gòu)建的載體，具有可感染非分裂細(xì)胞、目的基因穩(wěn)定有效整合至反應(yīng)細(xì)胞基因組且長期表達(dá)、對宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率高、免疫反應(yīng)小等優(yōu)點是目前最通用且最有效的基因轉(zhuǎn)載工具[12-14]。本實驗所構(gòu)建的慢病毒顆粒滴度達(dá)3.2×106IU/ml，對反應(yīng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率為90%。ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，編碼hGM-CSF慢病毒感染后，反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)的hGM-CSF表達(dá)量顯著提高，且持續(xù)表達(dá)2個多月。DC細(xì)胞內(nèi)hGM-CSF的持續(xù)高水平表達(dá)，為DC的遞呈作用提供了一個長期有利的局部體液環(huán)境，可以增強DC對腫瘤抗原的遞呈作用，刺激更多的腫瘤特異性CTL的增殖，達(dá)到更好的殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。MTT檢測結(jié)果也證實了這一推斷，編碼hGM-CSF慢病毒感染后，DC疫苗誘導(dǎo)的CTL對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力得到了顯著提高。

我們通過反復(fù)凍融人宮頸癌腫瘤細(xì)胞來獲取可溶性宮頸癌腫瘤抗原，使用這一可溶性腫瘤抗原沖擊DC制備DC疫苗，利用編碼hGM-CSF的慢病毒顆粒感染部分DC疫苗，與未經(jīng)感染的DC疫苗進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，無論是刺激同種T淋巴細(xì)胞增殖的能力還是誘導(dǎo)的CTL殺傷宮頸癌腫瘤細(xì)胞的能力，編碼hGM-CSF的慢病毒感染后的DC疫苗都略勝一籌。提示編碼hGM-CSF的慢病毒能夠顯著提高DC疫苗的抗腫瘤活性，可作為腫瘤生物治療的有效載體。

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Immunocompetence of dendritic cells transfected with lentiviral vector-encoding human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor

Objective To construct lentiviral vector encoding human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (hGM-CSF)gene and to investigate the immunocompetence of dendritic cell(DC)vaccine transfected with lenti-hGM-CSF．Methods DNA fragment of hGM-CSF was cloned from the plasmid pORFhGM-CSF with PCR and was inserted into the delivery vector L166 at the restriction nuclease sites BamHⅠand XhoⅠdirectionally to construct the recombinant vector L166-hGM-CSF．The recombinant vector L166-hGM-CSF,packing vector L205 and VSVG L311 were co-transfected into lentivirus packaging cell line 293T,and the lentivirus-produced lenti-hGM-CSF was gained from supernatant after 72h．Cord blood was collected to isolate monocytes which were cultured in medium supplemented with rhGM-CSF，rhIL-4 and α-TNF．Suspending cells were collected to analyze their phenotypes by flow cytometer．Tumor lysate was obtained by rapid freeze/thaw exposures．Dendritic cells pulsed with tumor lysate or dendritic cells pulsed with tumor lysate transfected with lenti-hGM-CSF were co-cultured with T lymphocytes．The killing activity of cytotoxic T lymphocytes(CTLs)activated by these DC vaccines were assayed by MTT method．Results The recombinant vector L166-hGM-CSF was successfully constructed,and human GM-CSF was presented highly in the supernatant of Hela cells transfected with lenti-hGM-CSF．The cytotoxic effects of DC pulsed with tumor lysate were significantly enhanced after transfected with lenti-hGM-CSF．Conclusion GM-CSF DC vaccine has been successfully prepared by trasfection of human GM-CSF to dendritic cells using the lentiviral vector,which demonstrates an enhanced anti-tumor effects in vitro．

Lentivirus VectorGranulocyte-macrophage colony-stimulating factorDendritic cellTumor vaccine

2013-01-29）

（本文編輯：楊麗）

山東省科技發(fā)展計劃項目（2004GG3202003）

310009 杭州市第三人民醫(yī)院病理科（林阿麗）；山東省千佛山醫(yī)院病理科（孫青）

孫青，E-mail：qingsw99@sina.com