川芎嗪抑制大鼠頸動脈球囊損傷后再狹窄的在體研究

華軍益 何煜舟 蔣旭宏 葉武 潘智敏

川芎嗪抑制大鼠頸動脈球囊損傷后再狹窄的在體研究

華軍益 何煜舟 蔣旭宏 葉武 潘智敏

目的 研究川芎嗪對大鼠頸動脈球囊損傷后再狹窄的影響及機制。 方法 建立SD大鼠頸動脈球囊損傷模型，分為假手術(shù)組、模型組和川芎嗪組。川芎嗪組為川芎嗪[10mg（kg·d）]尾靜脈預(yù)給藥1周，球囊成形術(shù)后繼續(xù)同劑量川芎嗪尾靜脈注射6周。于第6周末收集損傷段頸動脈，病理切片HE染色測量內(nèi)中膜厚度比及Western blot檢測相關(guān)蛋白表達水平。 結(jié)果 大鼠頸動脈球囊損傷后6周，損傷段血管內(nèi)膜明顯增厚，模型組和川芎嗪組與假手術(shù)組比較，內(nèi)膜/中膜面積比顯著增加（P＜0．05）；與模型組比較，川芎嗪組內(nèi)膜/中膜面積比下降（P＜0．05）。模型組損傷段血管Wnt 4、Dvl-1、β-catenin、Cyclin-D1表達表達水平較假手術(shù)組顯著增高，而川芎嗪組的表達明顯減少（均P＜0．05）。 結(jié)論 川芎嗪可以抑制大鼠頸動脈球囊損傷后再狹窄，其機制與下調(diào)Wnt信號通路有關(guān)。

川芎嗪 Wnt信號通路 血管再狹窄 血管內(nèi)膜

冠狀動脈支架術(shù)后血管再狹窄一直是影響介入治療效果的主要因素，深入研究血管再狹窄的病理機制和開發(fā)有效預(yù)防再狹窄的藥物具有現(xiàn)實意義。目前認為，血管中膜平滑肌細胞增殖、遷移和膠原大量合成導(dǎo)致內(nèi)膜增厚是血管再狹窄的主要病理改變[1-4]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)中、高濃度的川芎嗪能夠顯著抑制AngⅡ誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞（VSMC）增殖和膠原合成，其機制與下調(diào)Wnt4/Dvl-1/β-catenin信號通路有關(guān)[5]。本實驗通過建立大鼠頸動脈球囊損傷模型，進一步研究川芎嗪抑制動脈再狹窄的作用并探討其可能的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料、儀器和試劑

1.1.1 實驗動物及分組 SPF級SD大鼠24只，雌雄不限，體重350～400g，購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，普通飼料喂養(yǎng)，自由進食、飲水，室溫20～24℃，自然采光，動物喂養(yǎng)、手術(shù)和取材均在動物實驗中心完成。以隨機數(shù)字表法分為3組，每組8只：（1）假手術(shù)組：僅進行右頸動脈分離和結(jié)扎，局部皮膚縫合，不給予球囊成形術(shù)及任何處理；（2）模型組：予球囊成形術(shù)，術(shù)后通過灌胃器給予等容積0.9%氯化鈉注射液6周；（3）川芎嗪組：術(shù)前予尾靜脈給藥1周10mg/（kg·d），球囊成形術(shù)后繼續(xù)同劑量川芎嗪尾靜脈注射6周。

1.1.2 主要實驗儀器和試劑 顯微手術(shù)器械為上海醫(yī)療器械有限公司手術(shù)器械廠產(chǎn)品，動物手術(shù)操作臺、Endeavor sprinter 1.5×12mm PTCA球囊擴張導(dǎo)管為美國Medtronics公司產(chǎn)品，萊卡DM2500正置顯微鏡和LAS 3.8圖像拍攝系統(tǒng)為德國Leica公司產(chǎn)品。兔抗鼠βcatenin單克隆抗體購于美國Epitomics公司，兔抗鼠DVL-1抗體、Wnt 4抗體及Cyclin-D1抗體購于美國Bioss公司，兔抗鼠β-tubulin抗體購于美國Proteintech公司，HRP標記的羊抗兔IgG二抗購于美國Santa Cruz公司，瓊脂糖、RNA酶購于上海Sangon公司，川芎嗪凍干粉為哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 大鼠頸動脈球囊損傷的模型的建立 川芎嗪組大鼠術(shù)前1周每天尾靜脈推注川芎嗪注射液10mg/kg，第8天行球囊成形術(shù)。大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉30mg/ kg，麻醉后取頸部正中切口，從頸外靜脈注射肝素100U/kg，在右側(cè)氣管旁尋找到右頸總動脈和頸外、頸內(nèi)動脈分叉處，行鈍性分離。于右總頸動脈近心端用血管夾暫時阻斷血流，從頸外動脈處切開動脈，將1.5mm× 12mm PTCA球囊導(dǎo)管從切口仔細輕柔插入至頸總動脈約2.0cm，助手用壓力注射泵以5atm打開球囊，回抽球囊以剝脫內(nèi)膜，如此反復(fù)5次。將導(dǎo)管撤出后，結(jié)扎頸外動脈，恢復(fù)血流，縫合傷口。術(shù)后保暖復(fù)蘇后大鼠繼續(xù)在實驗動物中心普通飲食飼養(yǎng)，術(shù)后繼續(xù)同劑量川芎嗪尾靜脈注射6周。模型組大鼠只予球囊成形術(shù)，術(shù)后予等容積0.9%氯化鈉注射液灌胃6周。假手術(shù)組過程同上，僅在頸外動脈切開后不插入球囊導(dǎo)管進行損傷內(nèi)膜操作。

術(shù)后第6周末處死各組大鼠，腹腔注射過量的戊巴比妥鈉，開腹剪破腹主動脈放血后，取出損傷部位的左頸總動脈約1.0cm并分為兩段，一段用無水甲醛固定1～2d，石蠟包埋后行病理切片，HE染色后在光鏡下觀察血管內(nèi)膜增生情況，每份標本非連續(xù)取4處切片；另一段立即存入液氮罐凍存，再放置-80℃保存待行Western blot檢測。

1.2.2 大鼠頸動脈內(nèi)膜增生的檢測 各標本經(jīng)梯度乙醇脫水、透明、包埋后切片，行HE染色后在光鏡下觀察VSMC的形態(tài)及內(nèi)膜增生情況，采用Image Pro Plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件測定血管內(nèi)膜和中膜面積，并計算內(nèi)膜和中膜面積比。采用Image Pro Plus軟件進行圖像分析，計算管腔面積、內(nèi)外彈力板圍繞面積，內(nèi)膜和中膜厚度。，中。新生內(nèi)膜面積=內(nèi)彈力板圍繞面積-管腔面積。每只大鼠隨機取3張切片，每張切片測量3次，取平均值。

1.2.3 Western blot法檢測Wnt信號通路各蛋白表達提取細胞總蛋白，上樣檢測，化學(xué)發(fā)光試劑顯色，膠片貼近曝光，顯影、定影后用凝膠圖像分析軟件對膜片掃描測定區(qū)帶的感光密度，蛋白表達水平用目的片段與內(nèi)參β-tubulin的光密度比值（%）表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，常規(guī)進行方差齊性檢驗、正態(tài)性檢驗。計量資料以表示，方差齊者，兩組間的比較采用t檢驗，多組資料之間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用最小顯著性差異法。

2 結(jié)果

2.1 大鼠頸動脈球囊損傷模型 本實驗共24只大鼠，假手術(shù)組8只全部存活，模型組存活6只，川芎嗪組存活6只，模型制作成功率為75%。

2.2 大鼠頸動脈損傷處的病理改變

2.2.1 病理形態(tài)學(xué)改變 大鼠頸動脈球囊損傷后6周，HE染色后鏡下觀察提示模型組頸動脈內(nèi)膜出現(xiàn)明顯增厚，新生內(nèi)膜突向管腔，細胞與纖維排列均不規(guī)則，部分內(nèi)彈力板嚴重破壞，細胞外基質(zhì)沉積。與模型組相比，川芎嗪組的病理改變明顯減輕，內(nèi)外彈力板保存相對較完整，見插頁圖1。

圖1 頸動脈球囊成形術(shù)后大鼠動脈損傷處的病理改變（A：假手術(shù)組，HE染色，×40；B：假手術(shù)組，HE染色，×200；C：模型組，HE染色，×40；D：模型組，HE染色，×200；E：川芎嗪組，HE染色，×40；F：川芎嗪組，HE染色，×200；箭頭所示為頸動脈內(nèi)、外彈力板）

2.2.2 術(shù)后6周各組大鼠頸動脈內(nèi)膜增生情況 術(shù)后6周，模型組內(nèi)膜厚度、新生內(nèi)膜面積和內(nèi)膜/中膜面積比均高于假手術(shù)組，而川芎嗪組的內(nèi)膜厚度、新生內(nèi)膜面積及內(nèi)膜/中膜面積比均低于模型組（均P＜0.05），見表1。

表1 術(shù)后6周各組頸動脈內(nèi)膜增生情況

2.3 術(shù)后6周各組大鼠頸動脈損傷處相關(guān)蛋白表達 與假手術(shù)組比較，模型組Wnt信號分子表達增加，川芎嗪組的相應(yīng)蛋白表達下降（P＜0.05），見圖2及表2。

圖2 各組大鼠頸動脈損傷處相關(guān)蛋白表達

表2 各組相關(guān)基因的蛋白表達

3 討論

筆者前期體外實驗提示W(wǎng)nt信號通路激活可以促進VSMC增殖和合成膠原[5]，但這是在體外用VSMC株并由AngⅡ誘導(dǎo)而產(chǎn)生的情況。而在體環(huán)境情況要復(fù)雜得多，作為效應(yīng)細胞的VSMC受到體內(nèi)外各種復(fù)雜因素影響，是體外培養(yǎng)條件下無法模擬的，并有可能產(chǎn)生不同的結(jié)果，因此體外實驗結(jié)果還不能推導(dǎo)在體實際情況，需要在體實驗進一步證實。

目前大多數(shù)學(xué)者認為經(jīng)皮冠狀動脈成形術(shù)（PTCA）后再狹窄是由于動脈中膜平滑肌增生、遷移并分泌大量細胞外基質(zhì)形成增厚的新生內(nèi)膜造成[1-4]。大鼠頸動脈球囊損傷后2周發(fā)現(xiàn)新生內(nèi)膜形成，主要有增殖的平滑肌細胞（HE染色），排列紊亂結(jié)構(gòu)不完整，內(nèi)膜面粗糙，內(nèi)彈力板斷裂，6周時新生內(nèi)膜增厚明顯，部分平滑肌細胞增大、排列紊亂，提示其可能是具備增殖、遷移、合成細胞外基質(zhì)能力的合成表型的VSMC，表明球囊損傷后大鼠頸動脈發(fā)生了再狹窄的病理形態(tài)學(xué)改變[6-7]。川芎嗪干預(yù)的大鼠頸動脈增厚不明顯，提示川芎嗪可以抑制球囊損傷后血管內(nèi)膜的增厚，對血管再狹窄防治有療效。值得一提的是，在建立大鼠動脈損傷模型時，為了更好地模擬臨床PTCA對冠狀動脈損傷的真實場景，筆者僅作球囊擴張并拉動損傷頸動脈，不附加高脂飲食（冠心病患者PCI手術(shù)后往往強調(diào)低脂飲食和他汀治療）。

通過檢測損傷段血管的Wnt信號分子蛋白表達，發(fā)現(xiàn)損傷段頸動脈的Wnt4/Dvl-1/β-catenin/Cyclin-D1表達明顯增多，川芎嗪干預(yù)可以減少損傷段血管Wnt4/ Dvl-1/β-catenin的表達，同時減輕了血管內(nèi)膜增厚。結(jié)合體外細胞實驗結(jié)果，筆者認為，盡管在體內(nèi)受到多重因子的復(fù)雜作用，VSMC的Wnt信號通路也發(fā)生明顯上調(diào)，并參與了血管損傷后再狹窄的病理過程，即平滑肌細胞增殖，而川芎嗪抑制大鼠頸動脈損傷后內(nèi)膜增厚與下調(diào)Wnt信號通路有關(guān)。靜止狀態(tài)細胞不表達Cyclin-D1，當細胞受到生長因子等刺激時表達Cyclin-D1，促進細胞進入增殖狀態(tài)。Cyclin-D1是Wnt通路下游靶基因，筆者的體外實驗發(fā)現(xiàn)，＞40μmol/L的川芎嗪可以抑制AngⅡ誘導(dǎo)的Wnt信號分子和Cyclin-D1高表達，在體實驗中，川芎嗪組頸動脈Wnt信號分子和Cyclin-D1表達均下降，Cyclin-D1的變化進一步支持川芎嗪在體內(nèi)通過下調(diào)Wnt信號通路抑制動脈內(nèi)膜增生[5]。

川芎，原名芎藭，為傘形科蒿木鼠植物的根莖，常用于活血行氣，祛風止痛。而TMP是從中藥川芎中分離提純的有效成分,其化學(xué)結(jié)構(gòu)為四甲基吡嗪。廣泛用于高血壓病、冠心病等的防治。研究表明TMP具有擴張冠狀動脈、抗凝、抗血小板聚集、抗心肌缺血/再灌注損傷降低血壓、降低肺動脈高壓以及抑制VSMC增殖等多種心血管藥理作用[8]。有臨床研究證明，川芎嗪可以防治冠狀動脈支架介入術(shù)后再狹窄作用[9]。也有研究認為川芎嗪能抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VSMC增殖，可能是通過降低鈣調(diào)蛋白（CaM）和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（CaN）活性的而實現(xiàn)[10]，還有動物實驗表明川芎嗪可減輕大鼠內(nèi)皮損傷后內(nèi)膜的增生，其作用機制與降低纖維細胞生長因子（FGF）和c-myc的表達有關(guān)[11]。也因此被筆者選擇用來探討其抑制血管再狹窄作用。而本實驗進一步在在體水平證實了川芎嗪可以通過下調(diào)Wnt通路抑制血管內(nèi)膜增厚，并得到了動脈組織病理形態(tài)學(xué)證實。

綜上所述，Wnt信號經(jīng)典通路參與調(diào)控了血管再狹窄病理過程，有望成為抗血管再狹窄新的治療靶點；川芎嗪抑制血管再狹窄至少部分是通過下調(diào)Wnt信號通路實現(xiàn)的。

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Tetramethylpyrazine prevents balloon-injured carotid artery from restenosis in rats

Objective To investigate the preventive effect of tetramethylpyrazine (TMP)on balloon-injured rat carotid artery from restenosis．Methods Balloon-injured carotid artery model was established in SD rats．SD rats were divided into 3 groups:sham operation group(n=8);model group(n=8)and TMP group(n=8)．In TMP group,rats were pretreated with caudal vein injection of TMP(10mg/kg·d)for 1 week,and the same dose of TMP was continued for 6 weeks after balloon angioplasty．Injured segments of carotid artery were harvested at 6th week and embedded in paraffin wax to assess the size of intimal lesions by HE staining．Proteins expressions of Wnt4,Dvl-1,β-catenin and Cyclin-D1 were detected by Western blotting method．Results Six weeks after balloon injured,the intimal of injured artery became thickening．The ratio of intima/tunica media thickness and collagen volume in intima increased significantly compared to those of sham operation group(P＜0．05)．Compared to model group, the ratio of intima/tunica media thickness in TMP group reduced significantly(P＜0．05)．The expressions of Wnt4,Dvl-1, β-catenin and Cyclin-D1 proteins in model group increased significantly in comparison with sham operation group,while decreased in comparison with TMP group． Conclusion TMP can inhibit restenosis of balloon-injured carotid artery possibly through down-regulation of wnt signal pathway．

Tetramethylpyrazine Wnt signal pathway Restenosis Intima

2013-07-26）

（本文編輯：馬雯娜）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目（2010KWA155）；浙江省中醫(yī)藥科學(xué)研究基金項目（2011ZA027）

310006 杭州，浙江省中醫(yī)院心內(nèi)科（華軍益、何煜舟、蔣旭宏、葉武），干部科（潘智敏）

華軍益，E-mail:huajunyi1973@163.com