單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)檢測DNA損傷的方法及進(jìn)展

趙琳娜，陳薛釵，鐘儒剛

(北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京 100124)

單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)( single cell gel electrophoresis， SCGE)又稱“彗星電泳”(comet assay)，是一種常用的檢測DNA損傷的技術(shù)。1984年?stling和Johanson首先提出利用凝膠電泳技術(shù)來檢測單個(gè)細(xì)胞的DNA損傷，但他們所采用的中性電泳條件僅能檢測雙鏈DNA斷裂(double-strand breaks,DSB)，這在很大程度上限制了該技術(shù)的應(yīng)用[1]。但在接下來的幾十年里，彗星電泳技術(shù)得到了飛速的發(fā)展，一方面在改變自身實(shí)驗(yàn)條件下能夠檢測到單鏈、雙鏈DNA的斷裂損傷、DNA交聯(lián)損傷、檢測DNA加合物修復(fù)的切除位點(diǎn)。另一方面與熒光原位雜交技術(shù)相結(jié)合，利用不同的探針能夠檢測到該基因在癌癥病理樣本DNA中的豐度[3]，很多科研組利用Comet-FISH技術(shù)檢測到與癌癥發(fā)生相關(guān)的染色體位點(diǎn)[2,4]。由于彗星電泳技術(shù)與其他檢測DNA損傷技術(shù)相比具有靈敏度高、所需樣本少、經(jīng)濟(jì)、簡便、易操作、實(shí)驗(yàn)周期短等優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛的應(yīng)用于遺傳毒性試驗(yàn)、環(huán)境污染檢測和分子流行病學(xué)、生態(tài)病理學(xué)以及DNA損傷修復(fù)的基礎(chǔ)研究。

1 單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)的原理

真核細(xì)胞內(nèi)75%～90%的DNA以雙螺旋的形式，以組蛋白八聚體為核心形成負(fù)超螺旋結(jié)構(gòu)，從而構(gòu)成核小體。一般情況下，這種超螺旋的結(jié)構(gòu)使得DNA不能自由旋轉(zhuǎn)，但是如果出現(xiàn)DNA斷裂時(shí)，這種負(fù)超螺旋就會松散，環(huán)狀結(jié)構(gòu)就會從類核的核心伸展開來，形成暈輪。彗星電泳正是應(yīng)用了DNA的這一特性。利用去污劑破壞細(xì)胞膜和核膜，用高濃度鹽提取組蛋白，使得DNA殘留而形成類核。這時(shí)將類核置于電場中電泳，DNA斷片即可從類核部位向陽極遷移，形成類似彗星圖像一樣的拖尾。并且細(xì)胞核DNA受損傷越嚴(yán)重，電泳后表現(xiàn)的彗星尾長越長越亮。通過測量有無彗星及彗星尾部的長度、面積或熒光強(qiáng)度等指標(biāo)，可以對DNA的損傷程度進(jìn)行定量分析。

2 單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)的操作

2.1 制備玻片?？刹捎脝螌又颇z法、雙層制膠法或三層制膠法。在應(yīng)用單層制膠法時(shí)，受試細(xì)胞混合在無鈣鎂磷酸緩沖鹽溶液(PBS)配制0.5%～1.0%低熔點(diǎn)瓊脂糖(LMA)溶液,滴于潔凈的玻片上,立即蓋上蓋玻片,使瓊脂糖均勻地敷在載玻片上,置4℃下10 min待瓊脂糖冷卻變硬,取下蓋玻片。在應(yīng)用三層制膠法時(shí)，用1.0%～1.5%的正常熔點(diǎn)瓊脂糖(NMA)溶液鋪第一層膠，混有受試細(xì)胞的低熔點(diǎn)瓊脂糖鋪第二層膠，最后用低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液鋪第三層膠。而雙層制膠法則是在三層制膠法的基礎(chǔ)上取消了第三層膠。載玻片的選擇上有單面全磨砂載玻片和常規(guī)載玻片，磨砂載玻片對膠的附著能力強(qiáng)，但背景熒光強(qiáng)度高，呈現(xiàn)區(qū)域樣分布，影響后續(xù)的圖像采集和分析。常規(guī)載玻片的背景熒光強(qiáng)度與磨砂載玻片相比較低，沒有區(qū)域樣分布，但是在實(shí)驗(yàn)的過程中容易“脫膠”[5]。

2.2 裂解。取下蓋玻片,將載玻片立即浸入預(yù)冷的裂解液中,4℃下放置1 h以上,使細(xì)胞充分裂解,過夜亦可,但時(shí)間過長裂解液可能出現(xiàn)沉淀。裂解液是由2.5 M NaCl、100 mM Na2EDTA、 1%肌氨酸鈉、10 mM Tris組成,將pH值溶液調(diào)至10。臨用前加入1% Triton X-100及10%DMSO[6]。但McKelvey-Martin等人在試驗(yàn)中證明裂解液中不加1%肌氨酸鈉是沒有影響的[7]。

2.3 解旋、電泳和中和。裂解結(jié)束后，取出玻片，用去離子水沖洗玻片，然后放置在水平電泳槽中，加入預(yù)冷的電泳液(1 M Na2-EDTA,300 Mm NaOH,pH值大于13)。靜置20 min,待DNA解螺旋后,以25V 300 mA的條件電泳20 min。電泳完成后取出玻片，置于pH值7.5的0.4 M Tris溶液中中和3次，每次5 min。

2.4 染色、鏡檢和結(jié)果分析。染色時(shí)在每張玻片上滴加20～100 μL的熒光染色劑。常用的熒光染料有溴化乙錠(EB)[8]、碘化丙啶(PI)[9]、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)[10]、苯并惡唑啉(YOYO-1)[11]、SYBR Green I[12]gelRed[13]。熒光染料的濃度要適中，濃度過高會使膠板的背景很亮，影響結(jié)果分析，相反濃度過低會導(dǎo)致染色不充分，不易觀察。并且染色后要盡快檢測，時(shí)間過長熒光將褪色。為了減少額外的DNA損傷與修復(fù)，應(yīng)在黃光、紅光或暗室中進(jìn)行。1999年Kizilian等改進(jìn)了銀染技術(shù)，這種技術(shù)不僅提高了彗星電泳的靈敏性，在鏡檢時(shí)不需要熒光顯微鏡，不用擔(dān)心熒光淬滅，更重要的是這種方法有利于樣品玻片的長期保存。

在熒光顯微鏡下觀察單細(xì)胞電泳圖像一般放大200～400倍，每個(gè)樣本隨機(jī)分析100個(gè)細(xì)胞。觀察指標(biāo)可分成兩類：一類是人工指標(biāo)，包括彗星發(fā)生率、DNA損傷分級計(jì)數(shù)(從0到Ⅳ分成5個(gè)損傷等級)[14]以及一些距離指標(biāo)(頭長、尾長等)，這些指標(biāo)無需復(fù)雜的儀器，便于操作，但結(jié)果不精確。第二類是軟件分析指標(biāo)，目前比較常用的指標(biāo)有Olive等[15]提出的尾矩(Oliv尾矩=從頭光密度重心到尾光密度重心的距離與尾部DNA含量的乘積)，以及Arshby等[16]提出的尾矩(尾矩=從彗星頭的右邊界到彗星尾部末端的距離與尾部DNA含量的乘積)，均能很好地反映DNA損傷的程度。

3 單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)的改進(jìn)以及應(yīng)用范圍

3.1 分辨單鏈DNA斷裂和堿性易變位點(diǎn)

為了更好地發(fā)揮單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)的作用，研究者們對其做了多方面的改進(jìn)來檢測不同的DNA損傷。在解旋液和電泳液pH值大于13時(shí)，彗星電泳可以檢測到SSB、ALS和DNA交聯(lián)，這個(gè)時(shí)候展現(xiàn)出來DNA遷移是不能區(qū)分兩者的。Miyamae等人發(fā)現(xiàn)當(dāng)解旋液和電泳液pH值等于12.1的時(shí)候，結(jié)果中的DNA遷移僅表現(xiàn)SSB，此時(shí)ALS不能表達(dá)[17]。所以在pH值大于13條件下DNA遷移比pH值等于12.1有所增加時(shí)就表明此時(shí)有ALS損傷存在。相反，如果兩種條件下的DNA遷移相同，則表明僅存在SSB損傷。

3.2 檢測DNA-DNA交聯(lián)(DNA-DNA crosslinking，DDC)和DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)(DNA-Protein crosslinking,DPC)

近幾年來，彗星實(shí)驗(yàn)也被用于各種環(huán)境污染物致 DNA交聯(lián)作用的檢測。目前，國際上比較通用的檢測DNA交聯(lián)作用的彗星實(shí)驗(yàn)方法主要有兩種：第一種方法是在電泳時(shí)加大電壓和/或電流或者延長電泳時(shí)間。其原理是通過加大電壓和/或電流或者延長電泳時(shí)間使細(xì)胞核內(nèi)DNA在電場作用下發(fā)生明顯遷移。 而在交聯(lián)劑存在時(shí)，DNA的碎片附著在一起，從而使遷移率減小，鏡下觀察表現(xiàn)為彗尾變短尾部面積變小。第二種方法是在所試樣本染毒前，先加入標(biāo)準(zhǔn)致斷裂劑如甲磺基甲酯[18]、過氧化叔丁醇[19]、H2O2[20]、電離輻射[21]等。其原理是在標(biāo)準(zhǔn)斷裂劑作用下使DNA發(fā)生斷裂，形成很多小的DNA片段，而這些片段在交聯(lián)劑的作用下附著在一起，從而使遷移率減小。

檢測DPC時(shí)僅需要在裂解后加入0.5 mM的蛋白酶K 37℃水浴過夜,其余步驟同單細(xì)胞凝膠電泳基本操作。蛋白酶K能夠消除DNA交聯(lián)中的DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)，因此如果受試樣本損害DNA的方式是以DPC為主，那么在沒有加入蛋白酶K的實(shí)驗(yàn)組中DNA的遷移要比對照組小，而在加入蛋白酶K的實(shí)驗(yàn)組中會發(fā)現(xiàn)DNA的遷移和對照組是類似的[22]。

3.3 檢測DNA加合物

電離輻射、超聲波和一些化學(xué)試劑并不會對DNA產(chǎn)生直接的危害，而是攻擊DNA形成DNA加合物，如果此類DNA加合物不能及時(shí)清除和修復(fù)，就可能引起DNA突變并導(dǎo)致細(xì)胞癌變。 單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)經(jīng)過改進(jìn)后，可以檢測到這些DNA加合物。1992年Gedik等人利用UV限定核酸內(nèi)切酶檢測到紫外線誘導(dǎo)Hela細(xì)胞產(chǎn)生的嘧啶二聚體[9]。同一時(shí)期，Collins等人利用核酸內(nèi)切酶III檢測到DNA加合物氧化嘧啶[23]。1996年他們又發(fā)現(xiàn)了利用FPG酶(formamidopyrimidine DNA -glycosylase)能檢測到8-OH鳥嘌呤和其他損傷的嘌呤[24]。檢測DNA加合物時(shí)，DNA裂解后用酶緩沖液(40mM HEPES，0.1M KCl,0.5mM Na2EDTA,0.2 mg/mL牛血清白蛋白)在室溫下沖洗3次，每次5 min。完成后加入實(shí)驗(yàn)所選擇的酶孵育45 min，隨后解旋、電泳、鏡檢。如果檢測實(shí)驗(yàn)組的彗星尾部強(qiáng)度增加較對照組增加，則表明有DNA加合物的存在。

3.4 利用溴脫氧尿苷標(biāo)記法檢測DNA復(fù)制中的斷裂

細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制時(shí)，本身即會產(chǎn)生一定的DNA斷裂，而這將使彗星尾長增加。我們平常所用的彗星電泳的方法不可能辨別出DNA復(fù)制時(shí)產(chǎn)生的斷裂和DNA損傷時(shí)產(chǎn)生的斷裂，但是如果在DNA復(fù)制期間用5溴-2脫氧尿苷(BUdR)來標(biāo)記細(xì)胞，然后用5溴-2脫氧尿苷抗體顯色，即可觀察到DNA復(fù)制時(shí)S期所產(chǎn)生的斷裂已經(jīng)標(biāo)記并出現(xiàn)在彗尾：當(dāng)DNA復(fù)制完成后，5溴-2-脫氧尿苷標(biāo)記的DNA重新進(jìn)入彗星頭部[25]。

3.5 檢測DNA修復(fù)過程中的中間產(chǎn)物

彗星電泳圖像所顯示出的DNA斷裂并非完全由于受試藥物所致。有些斷裂是由于細(xì)胞自身切除修復(fù)UV誘導(dǎo)損傷或DNA加合物時(shí)所生成的核苷酸中間產(chǎn)物。此種斷裂通常是時(shí)間非常短暫的，特別是在增殖細(xì)胞中。當(dāng)我們把UV照射的細(xì)胞和DNA合成抑制劑羥基脲、阿糖胞苷或阿非迪霉素一起培養(yǎng)，將阻斷DNA斷裂的修復(fù)合成，這就會導(dǎo)致切除修復(fù)所引發(fā)的DNA斷裂的積累，通過這種方法，我們可以檢測到此類DNA損傷[9]。而在非分裂細(xì)胞如外周血淋巴細(xì)胞中，由于DNA斷裂的再連接的速率受到三磷酸脫氧核苷供應(yīng)不足的限制，所以即使沒用DNA合成抑制劑，也能夠觀察到此類DNA斷裂的積累[26,27]。

3.6 在檢測細(xì)胞凋亡中的應(yīng)用

細(xì)胞凋亡(Apoptosis) 是指生物體內(nèi)在特定的內(nèi)源和外源信號誘導(dǎo)下，其死亡途徑被激活，并在有關(guān)基因的調(diào)控下發(fā)生的程序性死亡過程。細(xì)胞凋亡的一個(gè)顯著特點(diǎn)是細(xì)胞染色體的DNA降解， 這種降解會形成大量的DSB[28]。因此無論是利用中性電泳還是堿性電泳都可以很輕易地檢測出細(xì)胞凋亡[29， 30]。凋亡的細(xì)胞單細(xì)胞凝膠電泳中會呈現(xiàn)獨(dú)特的“小頭扇尾”的形態(tài)學(xué)特征，而死亡的細(xì)胞呈現(xiàn)出“大頭長尾”的箭形狀態(tài)。在鏡檢的過程中能夠迅速準(zhǔn)確的區(qū)分凋亡和死亡的細(xì)胞。

3.7 彗星電泳和熒光原位雜交技術(shù)聯(lián)用

彗星電泳和熒光原位雜交技術(shù)聯(lián)用(Comet-FISH)是由Santos等人于1997年創(chuàng)立的[31]。這種技術(shù)在彗星電泳試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，在解旋和電泳完成后加入了雜交步驟，這樣就可以在DNA上標(biāo)記特定的基因序列，通過鏡檢可以檢測到目的基因所在DNA片段的損傷情況。如在彗星頭部檢測到FISH標(biāo)記的熒光信號，則表明目的基因所在DNA片段未受損傷；反之，如在彗星尾部發(fā)現(xiàn)熒光信號，則表明目的基因所在的DNA片段受到損傷并發(fā)生遷移。熒光原位雜交(FISH)通常是利用cDNA或寡聚核苷酸探針在DNA變性和復(fù)性的過程中識別目的基因的序列而雜交成功的，而如何能和包埋在37℃溶解的低熔點(diǎn)瓊脂糖中的受試DNA雜交，這是這一技術(shù)的關(guān)鍵所在，Santos等人沒有采用高溫使DNA變性，而是利用化學(xué)變性法。在加入探針前，先將玻片在變性液(0.5 M NaOH)中變性30min，然后在中和液(0.5 M Tris-HCl,pH值7.4的1 M NaCl)內(nèi)中和30 min,利用梯度乙醇溶液脫水后加入探針雜交。目前用這種方法可以識別特殊染色體的DNA、端粒DNA，著絲點(diǎn)DNA和單拷貝基因。Reiter等人[32]利用comet-FISH技術(shù)檢測了EGFR基因在病人口咽癌細(xì)胞的表達(dá)，從而證實(shí)了EGFR基因在口咽癌細(xì)胞中會過量表達(dá)。而Mosesso等人[33]利用這個(gè)技術(shù)研究了人的淋巴細(xì)胞經(jīng)過X射線電離輻射后，細(xì)胞體內(nèi)18號和19號染色體受到損傷和修復(fù)的差異性。盡管comet-FISH技術(shù)最近幾年發(fā)展迅速，但是到目前為止還沒有制定出關(guān)于這個(gè)技術(shù)的測定標(biāo)準(zhǔn)，這在一定程度上也限定了它的推廣。

4 展望

從上述內(nèi)容可以看出,彗星電泳的不同應(yīng)用方法可以檢測到多種的DNA損傷，它在檢測單個(gè)細(xì)胞的DNA損傷上的優(yōu)勢，是其它方法不可比擬的。目前這種方法已經(jīng)應(yīng)用于體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究中，很有潛力擴(kuò)展到各種細(xì)胞和組織的檢測[34]。2000年英國研究基因突變的權(quán)威機(jī)構(gòu)COM(UK Committee on Mutagenicity) 和2008年國際協(xié)調(diào)會議ICH(International Conference on Harmonisation)分別推薦彗星電泳作為體內(nèi)檢測手段而取代UDS實(shí)驗(yàn)( Unscheduled DNA Synthesis )，但是到目前為止還沒有得到任何機(jī)構(gòu)(OECD、ECVAM/ICVAM、WHO等)的認(rèn)可。另外由于沒有官方的實(shí)驗(yàn)指南作為指導(dǎo)，各個(gè)實(shí)驗(yàn)室在利用彗星電泳技術(shù)時(shí)，所應(yīng)用的條件和分析手段也不盡相同，這也導(dǎo)致了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可比性、重復(fù)性較差。盡管如此,單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)的諸多優(yōu)點(diǎn)仍然受到廣大科研者的青睞。相信隨著研究的深入，彗星電泳會有更加廣闊的應(yīng)用前景。

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