RNA干擾介導(dǎo)的抗HIV治療研究進(jìn)展

楊文思 王沂 王洋

（1.河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，保定 071000 ；2.河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院，唐山 063000；3.河北聯(lián)合大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，唐山 063000）

RNA干擾（RNA interference，RNAi）現(xiàn)象是指內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA（double strands RNA，dsRNA）與細(xì)胞內(nèi)的同源序列mRNA相結(jié)合并使之降解的現(xiàn)象，是一種序列特異轉(zhuǎn)錄后的基因沉默機(jī)制，其作用相當(dāng)于基因敲除。同傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)相比，RNAi技術(shù)具有高效、特異、操作簡單及設(shè)備依賴性低的優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中一種強(qiáng)大的實(shí)驗(yàn)工具。目前，實(shí)驗(yàn)中常用的RNAi手段主要包括直接轉(zhuǎn)染小或短干擾RNA（small/short interfering RNA，siRNA）以及轉(zhuǎn)染攜帶小或短發(fā)卡RNA（small/short hairpin RNA，shRNA）的質(zhì)粒。其中，siRNA是一類20多個核苷酸長度的雙鏈RNA分子，可以通過化學(xué)方法直接在體外合成，也可以體外轉(zhuǎn)錄合成或者由長片段dsRNA體外經(jīng)RNaseIII類酶降解后產(chǎn)生，然后通過轉(zhuǎn)染的方法導(dǎo)入細(xì)胞，作用時(shí)間相對較短。而shRNA是一段具有緊密發(fā)卡環(huán)（tight hairpin turn）的RNA序列，首先將其編碼DNA克隆到專門的表達(dá)載體中，通過載體導(dǎo)入細(xì)胞，在細(xì)胞中，shRNA被加工成siRNA，發(fā)揮抑制特異mRNA表達(dá)的作用。這種裝載了shRNA的載體可以通過篩選穩(wěn)定傳遞到子代細(xì)胞中去，從而使基因的沉默可被遺傳，因而作用時(shí)間更加長久穩(wěn)定［1］。自RNAi技術(shù)問世并成熟以來，因其高效、安全、作用特異的優(yōu)點(diǎn)很快就成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域所關(guān)注的對象。目前，RNAi療法已經(jīng)在包括腫瘤、炎癥、遺傳病、抗病毒及代謝性疾病等多個領(lǐng)域展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景，其中部分已經(jīng)進(jìn)入了臨床實(shí)驗(yàn)階段。

人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科，慢病毒屬，其基因組由兩條相同的正鏈RNA構(gòu)成，感染靶細(xì)胞后能夠逆轉(zhuǎn)錄為DNA并整合到宿主細(xì)胞基因組中，隨宿主細(xì)胞的基因復(fù)制并表達(dá)，是引起人類獲得性免疫缺陷綜合征（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS）的病原體。隨著醫(yī)療水平的進(jìn)步，艾滋病已經(jīng)成為一種可控的慢性傳染病。目前，高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療（HAART）是艾滋病的最根本的治療方法。但該方法只能控制病毒感染，降低死亡率和并發(fā)癥的發(fā)生率，并不能完全治愈AIDS，患者需要終生服藥，昂貴的治療費(fèi)用令普通患者難以承擔(dān)。因此，AIDS的治療仍是醫(yī)學(xué)界的一大難題。RNAi技術(shù)為AIDS的治療提供了新的手段，世界各地的多個研究小組致力于通過RNAi技術(shù)治療AIDS，并且已經(jīng)取得了初步的成果。本文是就RNAi抗HIV治療的研究進(jìn)展所作綜述。

1 抗HIV RNAi治療靶點(diǎn)的選擇

RNAi治療最關(guān)鍵的一點(diǎn)就是尋找合適的靶點(diǎn)。一般來說，抗HIV RNAi治療的靶點(diǎn)可以是HIV基因組本身，也可以是編碼HIV復(fù)制或感染關(guān)鍵蛋白的、宿主細(xì)胞來源的mRNA。到目前為止，幾乎所有的HIV編碼和調(diào)控基因都已經(jīng)被用作抗HIV RNAi治療的靶點(diǎn)并在體外實(shí)驗(yàn)中加以驗(yàn)證。其中效果比較好的包括tat、rev基因等［2］。來自宿主的RNAi靶點(diǎn)，目前已經(jīng)通過實(shí)驗(yàn)證明有效的包括NF-κB、CD4、趨化因子受體CCR5和CXCR4等，其中NF-κB是激活HIV-1基因表達(dá)的主要轉(zhuǎn)錄因子，而CD4、CCR5和CXCR4是HIV-1入侵靶細(xì)胞的主要受體，抑制這些分子的表達(dá)可以有效的抑制病毒復(fù)制和病毒感染過程［3，4］。

HIV病毒可以產(chǎn)生針對抗HIV RNAi的抵抗能力。產(chǎn)生這種抵抗現(xiàn)象的原因主要包括：（1）RNAi作用的靶RNA發(fā)生單一點(diǎn)突變；（2）靶點(diǎn)附近發(fā)生突變導(dǎo)致作用靶RNA空間結(jié)構(gòu)改變；（3）靶RNA發(fā)生缺失突變［5］。這些突變均可引起siRNA與靶RNA親和力降低甚至缺失，產(chǎn)生特異siRNA抵抗的病毒株。因而，采用單一siRNA很難達(dá)到長期抑制HIV復(fù)制的效果，為了解決此問題，一方面應(yīng)該盡量選擇病毒基因組中保守性比較強(qiáng)的序列作為RNAi的靶點(diǎn)；另一方面，可以選擇宿主細(xì)胞中對病毒復(fù)制起關(guān)鍵作用基因的轉(zhuǎn)錄本作為RNAi的靶點(diǎn)，因?yàn)樗拗骷?xì)胞的編碼基因極少會發(fā)生突變，因此也能減少逃逸突變發(fā)生的幾率；再者，解決此問題最好的方法是將多種針對不同靶點(diǎn)的siRNA組合應(yīng)用，從多個角度抑制病毒的復(fù)制、感染等過程［6，7］。此外，最近還發(fā)現(xiàn)，HIV存在一種交叉抵抗機(jī)制，即HIV對某一種siRNA突變產(chǎn)生逃逸的同時(shí)，可以對另一種針對不同靶點(diǎn)的siRNA產(chǎn)生逃逸，此兩種siRNA的靶點(diǎn)可能相距幾千個堿基，但其產(chǎn)生的具體機(jī)制仍然未知［8］。這一發(fā)現(xiàn)為RNAi抗HIV治療靶點(diǎn)的選擇提出了更高的要求。

鑒于宿主細(xì)胞基因產(chǎn)物在抗HIV RNAi治療中不易產(chǎn)生突變逃逸的優(yōu)點(diǎn)，目前，抗HIV新靶點(diǎn)的開發(fā)主要集中在人類病毒復(fù)制相關(guān)基因上。近年來，世界各地的多個研究團(tuán)隊(duì)通過全基因組RNAi技術(shù)對人類基因組進(jìn)行篩選，各團(tuán)隊(duì)在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和研究角度上略有不同，導(dǎo)致鑒定出的結(jié)果不盡相同。自2008年以來，累計(jì)鑒定出了上千個與HIV復(fù)制密切相關(guān)的宿主來源基因，首次發(fā)現(xiàn)其中很大一部分基因與HIV的復(fù)制相關(guān)，這些研究為抗HIV的RNAi治療提供了大量可能的靶點(diǎn)，有些靶點(diǎn)已經(jīng)被用于實(shí)驗(yàn)性抗HIV治療，并取得了比較好的效果［9-17］。

2 抗HIV RNAi治療的手段

目前，RNAi介導(dǎo)的抗HIV治療主要包括不需要載體的siRNA治療以及載體介導(dǎo)的shRNA治療。

2.1 SiRNA介導(dǎo)的靶向抗HIV治療

SiRNA用于體內(nèi)抗HIV治療所面臨的最大難點(diǎn)是缺乏有效的siRNA體內(nèi)傳遞機(jī)制，這一瓶頸嚴(yán)重限制了其在臨床上的應(yīng)用。siRNA的生物學(xué)本質(zhì)決定了其極不穩(wěn)定、很容易被核酸酶降解，同時(shí)容易引發(fā)宿主的免疫反應(yīng)，不易透過細(xì)胞膜，因而直接注射到血液中幾乎完全不能發(fā)揮作用。因此，探索一種將siRNA通過血液循環(huán)高效準(zhǔn)確的輸送進(jìn)入靶細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制成為了RNAi技術(shù)應(yīng)用于臨床函待解決的關(guān)鍵問題，同時(shí)也是最具挑戰(zhàn)性的問題。目前，已經(jīng)有多種能夠保護(hù)siRNA在血液中不被短期內(nèi)降解的方法被報(bào)道。例如，將siRNA進(jìn)行化學(xué)修飾、構(gòu)建包含siRNA的納米顆粒等。但血液中細(xì)胞成分多種多樣，注射入血液的siRNA即使不被降解，也很有可能被血管內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和紅細(xì)胞等非靶細(xì)胞吸收而失去效應(yīng)。并且在實(shí)踐中，HIV的靶細(xì)胞——T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞對于siRNA來說都是難以被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。針對這一問題，最近的一些研究均采用了靶向傳遞方法并取得了較好的效果。

2.1.1 抗體介導(dǎo)的siRNA靶向治療 一直以來，抗體都是介導(dǎo)靶向治療最經(jīng)典、最有效的媒介物。目前，已在實(shí)驗(yàn)中用于介導(dǎo)RNAi治療的抗體包括抗CD7、gp120和LFA-1抗體等。一般來說，與抗原結(jié)合后能夠發(fā)生內(nèi)化的抗體是靶向RNAi治療的最佳選擇，在siRNA和內(nèi)化抗體的嵌合體中，抗體既能起到靶向作用又能介導(dǎo)siRNA進(jìn)入靶細(xì)胞。但能夠介導(dǎo)內(nèi)化的抗體并不容易制備，研究者常常通過一些基因工程或者化學(xué)修飾的方法實(shí)現(xiàn)抗體介導(dǎo)的內(nèi)化，目前常用的方法包括穿透肽導(dǎo)入法及免疫脂質(zhì)體法。穿透肽通常是一段富含堿性氨基酸殘基的短肽，與抗體相連后能夠介導(dǎo)抗體內(nèi)化。Kumar等［18］將CD7單鏈抗體與9個精氨酸殘基構(gòu)成的穿透肽相連成為內(nèi)化抗體，將此融合抗體與針對HIV-1 vif、tat基因以及針對宿主細(xì)胞CCR5基因的siRNA相連后注射入人源化HIV-1病毒血癥的小鼠體內(nèi)，結(jié)果有效的抑制了內(nèi)源性病毒的復(fù)制并且重新恢復(fù)了CD4+T細(xì)胞數(shù)量。HIV-1 gp120糖蛋白位于病毒外殼表面以及被感染的細(xì)胞表面，因而可以用作區(qū)分HIV-1感染的細(xì)胞和正常細(xì)胞的標(biāo)志，非常適于作為抗HIV-1靶向治療的靶點(diǎn)。Song等［19］將gp120抗體重鏈與天然穿透肽——魚精蛋白偶聯(lián)成為內(nèi)化抗體。將該內(nèi)化抗體與針對宿主基因的siRNA連接后靜脈注射小鼠，檢測各種細(xì)胞中siRNA目的基因的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，僅gp120表達(dá)細(xì)胞中目的基因的表達(dá)被抑制，而其它細(xì)胞未受影響。將gp120內(nèi)化抗體與針對HIV-1 gag基因的siRNA偶聯(lián)后，可以抑制難以轉(zhuǎn)染的HIV-1感染T細(xì)胞中病毒的復(fù)制。

免疫脂質(zhì)體是將單克隆抗體或基因工程抗體共價(jià)結(jié)合在脂質(zhì)體表面，由抗體攜帶脂質(zhì)體到靶細(xì)胞表面，脂質(zhì)體通過細(xì)胞吞噬、融合等方式進(jìn)入靶細(xì)胞并釋放內(nèi)容物。該種方法的優(yōu)點(diǎn)在于實(shí)現(xiàn)靶向內(nèi)化的同時(shí)借助脂質(zhì)體保護(hù)了內(nèi)容物不被降解，后一優(yōu)點(diǎn)對于脆弱的siRNA尤為關(guān)鍵。淋巴細(xì)胞功能抗原-1（LFA-1）為整合素家族蛋白，該蛋白特異性的高表達(dá)在所有白細(xì)胞表面，包括T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞，這些細(xì)胞在HIV感染和致病過程中發(fā)揮著重要的作用。這一特點(diǎn)使LFA-1抗體成為傳遞siRNA到血液系統(tǒng)靶細(xì)胞的理想載體。Kim等［20］將LFA-1靶向的免疫脂質(zhì)體包裹CCR5 siRNA成為納米顆粒，注射病毒血癥的人源化小鼠能夠有效地抑制病毒的擴(kuò)增以及感染造成的CD4+T細(xì)胞減少。

2.1.2 適體（aptamer）介導(dǎo)的siRNA靶向治療 適體是具有獨(dú)特的二級和三級結(jié)構(gòu)，能與有機(jī)化合物或蛋白質(zhì)等配體專一和高效結(jié)合的RNA或DNA片段。利用適體的這種特性，可以介導(dǎo)siRNA的細(xì)胞特異性傳遞。適體和siRNA的共價(jià)嵌合體可以通過體外轉(zhuǎn)錄的方式非常方便的大規(guī)模生產(chǎn)。Neff等［21］將能夠與HIV包膜蛋白gp120特異結(jié)合的適體RNA和抗HIV-1 siRNA結(jié)合。對這種適體RNA進(jìn)行2’氟化修飾后能夠與HIV-1 gp120蛋白發(fā)生特異性結(jié)合并引起內(nèi)化。Zhou等［22］將針對gp120的適體蛋白進(jìn)行了優(yōu)化，使其成為一種雙功能適體RNA，一方面可以作為載體運(yùn)輸siRNA到靶細(xì)胞；另一方面適體本身與HIV-1表面gp120結(jié)合后阻斷HIV-1的感染作用。將gp120適體-siRNA嵌合體每周一次、連續(xù)幾周注射HIV-1病毒血癥的小鼠，HIV-1病毒載量明顯下降。

CD4是HIV進(jìn)入宿主T細(xì)胞的最重要的受體途徑。CD4適體可以阻斷HIV-1與CD4分子的作用。CD4適體-siRNA嵌合體RNA被特異性地用來向CD4+細(xì)胞運(yùn)輸siRNA，可以在體外以及宮頸組織移植物中抑制目的基因的表達(dá)。該適體-siRNA嵌合體被血管內(nèi)注射用于人源化小鼠模型時(shí)，其攜帶的針對HIV gag和vif或宿主CCR5的siRNA能夠有效地防止病毒傳播到宮頸移植物［23］。

截止目前，至少在人源化小鼠中，細(xì)胞特異性siRNA運(yùn)輸用于治療HIV-1感染取得了很好的效果。下一步非人靈長動物的實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步驗(yàn)證其安全性和效率。

2.2 shRNA介導(dǎo)的基因治療

一名伴有AIDS的白血病患者在接受了一次造血干細(xì)胞移植后，卻意外的治愈了AIDS，HIV-1感染被完全清除，原因在于這名供者的造血干細(xì)胞是細(xì)胞因子受體CCR5缺失的純合子，移植進(jìn)患者的干細(xì)胞由于缺乏HIV-1感染所需的共受體CCR5而不能被HIV-1感染［24］。這個病例雖然僅是一個個例，卻為AIDS的治療提供了新的思路，即通過重建造血系統(tǒng)抵抗HIV-1的感染。但是CCR5-/-且配型合適的供者并不容易獲得，從而嚴(yán)重限制了這一治療方法的應(yīng)用。因此，有必要研究一種機(jī)制類似的、可操作性更強(qiáng)的抗HIV療法。采用自體干細(xì)胞在體外基因修飾后重新輸回體內(nèi)重建造血不失為一種很有前途的治療AIDS的替代方法。shRNA具有可以整合到宿主細(xì)胞基因組、穩(wěn)定表達(dá)、作用時(shí)間持久的優(yōu)點(diǎn)，被看作此種治療最有效的手段，而慢病毒載體則被視為介導(dǎo)shRNA整合入宿主細(xì)胞基因組的最佳媒介。慢病毒載體最大的優(yōu)點(diǎn)是可以感染非分裂期的造血干細(xì)胞，并且高效的整合到細(xì)胞的基因組中，穩(wěn)定傳遞到子細(xì)胞中并長期表達(dá)，產(chǎn)生持久的治療效果。慢病毒載體介導(dǎo)shRNA治療的另一個優(yōu)點(diǎn)是可以將多個針對不同靶點(diǎn)的shRNA或者抑制HIV復(fù)制的其它元件構(gòu)建在一株慢病毒載體中，通過一次穩(wěn)定感染，達(dá)到多重抑制的效果，從而有效、方便的避免了治療逃逸現(xiàn)象的發(fā)生。

Li等［25］將包括tat/rev shRNA、針對CCR5的錘頭狀核酶以及核仁內(nèi)反式激活反應(yīng)元件類似物（nucleolar-localizing TAR decoy：抑制TAR元件與DNA的結(jié)合）在內(nèi)的3種抗HIV-1元件串聯(lián)排列構(gòu)建入慢病毒載體，重組慢病毒體外感染造血干細(xì)胞后自體回輸入4名感染HIV-1的血液病患者體內(nèi)。結(jié)果顯示，整合了3種抗HIV-1元件的造血干細(xì)胞可以分化成各種系列的血細(xì)胞，移植后24個月仍可在外周血各系血細(xì)胞中檢測到siRNA和核酶的表達(dá)。Walker［26］構(gòu)建了一株包含CCR5 shRNA、人類/獼猴TRIM5α基因和核仁內(nèi)反式激活反應(yīng)元件類似物的慢病毒載體，感染了該重組慢病毒的CD34+造血干細(xì)胞在人源化免疫缺陷小鼠體內(nèi)可以分化為HIV-1抗性的CD4+T細(xì)胞。髓系來源的HIV-1靶細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞，常常作為HIV-1的細(xì)胞儲存庫，但這兩種細(xì)胞對重組慢病毒感染具有極強(qiáng)的抗性，對慢病毒介導(dǎo)的shRNA治療不敏感。Bobadilla等［27］將一段猴免疾缺陷病毒（SIV）/HIV-2來源的Vpx蛋白編碼序列引入慢病毒載體，該蛋白能夠增強(qiáng)病毒cDNA向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)位和基因組整合，顯著提高了慢病毒載體對巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞的感染能力。這些實(shí)驗(yàn)的成功充分證實(shí)了以shRNA為基礎(chǔ)的細(xì)胞療法治療AIDS的可行性和有效性。

MicroRNA （miRNA） 是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22 個核苷酸的非編碼單鏈RNA 分子，在分子特征、生物合成和作用機(jī)理上與siRNA非常相近，可以看作是內(nèi)源siRNA。多種功能相關(guān)的miRNA編碼基因常在基因組上成簇排列，受RNA聚合酶Ⅱ型啟動子調(diào)控而表達(dá)。受此啟發(fā)，一些研究者將shRNA、核酶等HIV-1抑制元件的編碼序列取代某一miRNA基因簇上miRNA編碼基因，或者直接模仿miRNA基因簇構(gòu)建包含上述RNA元件編碼序列的人工多順反子，然后通過慢病毒介導(dǎo)整合靶細(xì)胞，使靶細(xì)胞可以長時(shí)間有效抵抗HIV-1感染而不影響靶細(xì)胞的生物學(xué)性狀［28，29］。由于采用了更加高效且種類繁多的RNA聚合酶Ⅱ型啟動子，因而通過選擇合適的啟動子可以實(shí)現(xiàn)siRNA的可控和組織特異性表達(dá)。

除慢病毒載體外，泡沫病毒也被用于實(shí)驗(yàn)性抗HIV shRNA治療。Kiem等［30］將tat/rev shRNA與膜結(jié)合HIV-1融合抑制肽C46編碼序列串聯(lián)構(gòu)建入泡沫病毒載體，感染了該重組泡沫病毒的人類CD34+細(xì)胞在免疫缺陷小鼠體內(nèi)得到了充分的擴(kuò)增，為泡沫病毒介導(dǎo)HIV-1 shRNA治療的可行性提供了依據(jù)。

3 其他

除了siRNA導(dǎo)入靶細(xì)胞手段的研究外，一些研究團(tuán)隊(duì)旨在通過生物信息學(xué)方法對抗HIV siRNA以及shRNA的設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化，以期提高抑制效率，減少細(xì)胞毒性。Low 等［31］通過高分辨率引物延伸選擇性2’羥基?；治龇ǎ╯elective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension，SHAPE），對已知的HIV-1 RNA的分子內(nèi)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，RNAi抑制效率與靶RNA熱力學(xué)特點(diǎn)的關(guān)系。依照該關(guān)系設(shè)計(jì)的shRNA比普通設(shè)計(jì)的shRNA抑制效率更高且?guī)缀鯖]有細(xì)胞毒性。

Tyagi等［32］總結(jié)了所有抗HIV RNAi研究的結(jié)果，構(gòu)建了一個名為HIVsirDB的免費(fèi)數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫收錄了目前實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證可以沉默HIV基因的所有siRNA，詳細(xì)介紹了每個siRNA的序列、靶RNA位點(diǎn)、針對HIV病毒株、抑制效率以及序列保守性等信息，這一數(shù)據(jù)庫的開發(fā)為今后HIV的RNAi治療提供了重要的借鑒。

4 小結(jié)

RNAi介導(dǎo)抗HIV治療在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中取得了一定成果，并顯示出了良好的前景，但距離真正應(yīng)用于臨床可能還需要很長一段時(shí)間。一些重要的技術(shù)問題仍然亟待解決，如最佳RNAi靶點(diǎn)的確立，如何將siRNA有效、特異的導(dǎo)入HIV感染細(xì)胞、如何進(jìn)一步延長shRNA在血細(xì)胞中表達(dá)時(shí)間及病毒載體導(dǎo)入安全性等。但隨著RNAi相關(guān)技術(shù)手段的不斷進(jìn)步，對HIV致病生存機(jī)制更深刻理解，RNAi介導(dǎo)的抗HIV治療將會成為AIDS治療中的一個極為重要的手段。

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