新霉素發(fā)酵液提取工藝的優(yōu)化研究

邱小明

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新霉素發(fā)酵液提取工藝的優(yōu)化研究

邱小明

（漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品與生物工程系，福建 漳州 363000）

新霉素對熱較敏感，現(xiàn)有提取工藝主要采用蒸發(fā)脫氨和濃縮，提取率僅達(dá)75％，殘余的新霉素以廢水方式排放，增加了污染物的排放。本研究通過工藝改進(jìn)經(jīng)732樹脂動(dòng)態(tài)吸附與洗脫，新霉素的交換量為142.9 mg?ml-1樹脂，洗脫收率高于96％，同時(shí)減少了工藝水的用量。用LSA—700樹脂脫色效果優(yōu)異711樹脂，新霉素回收率達(dá)92.1%，色素OD值為0.38。最后通過200Da 分子量的納濾膜組件處理可有效去除物料中的NH4OH，新霉素的收率高于99.4％，副產(chǎn)物氨水可回收利用。優(yōu)化后的新霉素提取率達(dá)88.2%，高于工廠現(xiàn)有水平，說明本工藝能夠很好地應(yīng)用于新霉素的提取。

新霉素；發(fā)酵液；提??；脫色；納濾

微生物經(jīng)發(fā)酵過程制得的發(fā)酵液中目的產(chǎn)物濃度較低,一般在10%以下[1]，有些甚至只有萬分之幾, 其余成分主要是水及細(xì)胞、代謝產(chǎn)物和未用完的培養(yǎng)基等[2]。微生物代謝過程產(chǎn)生較多的副產(chǎn)物，難以分離純化，目前作為下游的生化分離和純化手段往往步驟繁煩、處理時(shí)間長、收率低，嚴(yán)重地制約了新生物制品的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。生化分離純化新技術(shù)的主要發(fā)展趨勢是進(jìn)行各種分離技術(shù)的優(yōu)化集成，把兩種以上的分離技術(shù)合成為一種更有效的分離技術(shù)，以達(dá)到提高產(chǎn)品收率、降低過程能耗和增加生產(chǎn)效益的目標(biāo)。因此加強(qiáng)分離純化新技術(shù)的集成研究，提高單元分離操作的效率，同時(shí)縮短整個(gè)下游過程的操作時(shí)間和流程，發(fā)展高效生物分離技術(shù)成為生物工程技術(shù)領(lǐng)域的一個(gè)重要研究課題[3]。

納濾是近年來發(fā)展起來的一種介于超濾與反滲透之間的膜過濾方法，在制藥行業(yè)中，納濾膜可用于抗生素、維生素、氨基酸、酶等發(fā)酵液的澄清除菌過濾、蛋白剔除、分離與純化；6-APA，7-APA，7ADC及其他半合成抗生素的脫鹽濃縮等[4-5]。

新霉素對熱較敏感，現(xiàn)有工藝主要采用蒸發(fā)工藝脫氨和濃縮，難以獲得高的提取率，目前福州一醫(yī)藥有限公司新霉素的提取率僅達(dá)75％，殘余的新霉素以廢水方式排放，增加了污染物的排放量。因此迫切需要尋找一種有效的分離純化方法來提高新霉素的提取率,降低污染物的排放。本研究采用離子交換技術(shù)結(jié)合膜分離技術(shù)等高效分離手段，提高了新霉素的提取率，降低了廢水中新霉素的含量，達(dá)到了清潔生產(chǎn)的目的。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 儀器及實(shí)驗(yàn)材料

PELambda Bio10紫外-可見光光度計(jì)（美國產(chǎn)）；

膜分離裝置（廈門三達(dá)膜公司）;

Beckman Allegra64R高速離心機(jī)（美國Beckman公司）；

732（苯乙烯-二乙烯苯，磺酸基（-SO3H））離子交換樹脂（上海華震）；

LSA—700樹脂（上海華震）；

711、1300樹脂（上海華震）；

OL1812C-47P 7885269和DK18120-47P 7885249納濾膜（廈門三達(dá)膜公司）。

1.2 分析方法

新霉素效價(jià)測定采用OPA柱前衍生化法[6]，色素（OD）測定用分光光度計(jì)，在460nm下，以純水作為參比，測定色素含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取工藝比較

2.1.1 現(xiàn)有工藝流程

福州一醫(yī)藥有限公司新霉素現(xiàn)有的提取工藝流程是將放罐發(fā)酵液加水稀釋后直接與離子交換樹脂混合，吸附提取有效成分，提取后的發(fā)酵液用水稀釋后直接排放至污水處理車間（如圖1）。由于發(fā)酵液中含有大量的不溶性花生餅粉、菌絲體、蛋白質(zhì)和其他一些大分子等雜質(zhì)，在吸附過程中這些雜質(zhì)容易附著在樹脂上，需要用數(shù)倍體積的水來漂洗吸附后的樹脂，產(chǎn)生大量高濃度的廢水。該提取工藝不僅對產(chǎn)品質(zhì)量和提煉效果有較大的制約，而且對廢水的治理帶來了十分沉重的壓力,增加了整個(gè)污水處理運(yùn)行費(fèi)用,不符合現(xiàn)代生物制藥企業(yè)的清潔生產(chǎn)的要求[7]。

圖1 現(xiàn)有工藝流程圖

2.1.2 新工藝流程

本工作試圖采用直接離心或過濾的手段對發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理，分離上清液和固形物，過濾所得的固形物可作為飼料出售，同時(shí)省去加水稀釋和用水漂洗樹脂的步驟，大大降低了水的耗用量。

圖2 新工藝流程圖

2.2 732離子交換樹脂吸附與解吸

2.2.1 732離子交換樹脂對新霉素靜態(tài)吸附與動(dòng)態(tài)吸附的比較

根據(jù)福州一醫(yī)藥有限公司現(xiàn)有情況，我們選用732離子交換樹脂，采用靜態(tài)和動(dòng)態(tài)吸附方式測定新霉素發(fā)酵液的吸附量，考察這兩種吸附方式對新霉素的吸附性能。

靜態(tài)吸附：在室溫下取濕樹脂20ml置于200ml、19.4mg/ml離心后的新霉素發(fā)酵液中 ,用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢杌旌现两粨Q平衡后，測定其殘液濃度,計(jì)算出樹脂的吸附量（平行做三次）。

動(dòng)態(tài)吸附：在室溫下取濕樹脂50ml填裝于1.6cm×45cm玻璃柱中，發(fā)酵液濃度為19.4 mg?ml-1、流速2 ml?min-1，上柱液總量為理論飽和交換量的三倍（一般強(qiáng)酸性樹脂的理論飽和交換容量為150 mg?ml-1樹脂）。所以用1500ml的發(fā)酵液上柱于強(qiáng)酸性樹脂。交換完成后，測定其殘液的濃度，計(jì)算出樹脂的吸附量（平行做三次）。樹脂靜態(tài)和動(dòng)態(tài)吸附結(jié)果見表1。

表1 732樹脂靜態(tài)和動(dòng)態(tài)靜態(tài)吸附結(jié)果比較

根據(jù)測定的靜態(tài)吸附后殘液濃度（6.25 mg?ml-1）說明732離子交換樹脂靜態(tài)吸附已經(jīng)達(dá)到飽和。比較動(dòng)態(tài)和靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，動(dòng)態(tài)吸附比靜態(tài)吸附的交換量大，原因在于，動(dòng)態(tài)吸附是種動(dòng)態(tài)平衡過程，而靜態(tài)吸附只是達(dá)到體系的整體平衡。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中我們就選用動(dòng)態(tài)吸附來研究新霉素的提取情況。同時(shí)在實(shí)驗(yàn)中我們還考察了流速和PH對動(dòng)態(tài)吸附的影響發(fā)現(xiàn)差別不大，最后確定動(dòng)態(tài)吸附的條件為流速2 ml?min-1、PH為發(fā)酵液PH（6.8-6.9）新霉素的吸附量為142.9 mg?ml-1樹脂。

2.2.2 氨水濃度對洗脫結(jié)果的影響

經(jīng)過上述動(dòng)態(tài)吸附后的樹脂，我們利用1%、2%、3%和4%四種濃度的氨水進(jìn)行解吸洗脫，控制合適的洗脫條件（洗脫流速為2 ml?min-1），得到解吸液測定其效價(jià)，其得率結(jié)果見表2。

表2 不同濃度氨水解吸得率結(jié)果比較

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明3%、4%兩種濃度的氨水的解吸效果基本相近，考慮到氨水的利用率，以及后續(xù)的納濾操作，本實(shí)驗(yàn)確定3%的氨水為適宜的解吸液濃度，實(shí)驗(yàn)洗脫得率為96.3%，洗脫效果好。

2.3 新霉素洗脫液脫色研究

脫色是抗生素提取中的一個(gè)關(guān)鍵步驟，此步驟操作的好壞，不僅影響到下一步工序，更是關(guān)系到成品的色級等質(zhì)量指標(biāo)的好壞。目前生產(chǎn)上多采用711樹脂脫色，但711樹脂的運(yùn)轉(zhuǎn)周期短，容易中毒失效，繼而影響成品的質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)采用了一種新的脫色樹脂LSA-700，并以711和1300樹脂進(jìn)行對照實(shí)驗(yàn)。

2.3.1 樹脂預(yù)處理

吉林省出臺的《關(guān)于加強(qiáng)孤兒保障工作的實(shí)施意見》中規(guī)定：加強(qiáng)孤兒成年后就業(yè)扶持。按規(guī)定落實(shí)好社會保險(xiǎn)補(bǔ)貼、崗位補(bǔ)貼等扶持政策，及時(shí)將成年后就業(yè)困難且符合條件的孤兒納入就業(yè)援助范圍，有針對性地提供就業(yè)幫扶。孤兒成年后自主創(chuàng)業(yè)的，按優(yōu)于大學(xué)生自主創(chuàng)業(yè)的條件，享受創(chuàng)業(yè)稅收優(yōu)惠，需貸款扶持的，優(yōu)先享受小額擔(dān)保貸款。拓寬孤兒成年后就業(yè)渠道。在開發(fā)公益性崗位時(shí)，對成年后就業(yè)困難或參軍復(fù)員的孤兒，優(yōu)先安排其到政府開發(fā)的公益性崗位就業(yè)。在實(shí)施高校畢業(yè)生到社區(qū)、村任職選聘工作中，優(yōu)先錄用符合條件的孤兒。參軍復(fù)員的孤兒，優(yōu)先安排工作。

取LSA—700樹脂100ml，裝入交換柱中（3cm×14cm）。分別用4%的NaOH和HCl洗脫，然后水洗至pH6.5～7.0；轉(zhuǎn)型時(shí)再用4%的NaOH以4ml?min-1的流速通過樹脂層，通過量約400ml，水洗至pH<9，再投入使用。711和1300樹脂也進(jìn)行相同的處理和裝柱。

2.3.2 脫色處理

將處理好的LSA—700樹脂、711和1300樹脂各100ml分別裝柱（平行試驗(yàn)各3次），將732飽和樹脂解吸液(濃度137.7 mg?ml-1)的洗脫液1000ml上柱,上柱流速為2ml?min-1,過柱脫色,用三倍體積的去離子水洗滌，分別用HPLC和分光值檢測新霉素的回收率和色素OD值[8]（Ev），結(jié)果見表3。

表3 幾種不同樹脂脫色效果比較

由上表分析可知，LSA—700樹脂的脫色性能明顯優(yōu)于711和1300樹脂，洗脫回收率達(dá)92.1%色素OD值為0.38，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中我們選擇LSA—700來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.4 脫氨與濃縮

經(jīng)過脫色的解吸液中含有高濃度的氨，且解吸液中新霉素濃度不高，需要進(jìn)行脫氨和濃縮。目前工業(yè)化生產(chǎn)工藝中結(jié)晶前物料的濃縮采用薄膜蒸發(fā)技術(shù)，由于新霉素的熱穩(wěn)定性低，無法提高濃縮倍數(shù)，導(dǎo)致結(jié)晶效率低，大量抗生素隨母液排放，構(gòu)成生產(chǎn)過程中的第二大污染源。

由于納濾膜對分子量200-2000 Da之間的有機(jī)物具有很強(qiáng)的截留率，而對小分子的截留率低，因而在壓力驅(qū)動(dòng)下可以很快地實(shí)現(xiàn)對低分子有機(jī)物的純化、濃縮和水中高價(jià)離子的去除。根據(jù)新霉素的分子量（774），本實(shí)驗(yàn)通過試驗(yàn)比較最后采用廈門三達(dá)公司的1810型納濾設(shè)備進(jìn)行脫氨和濃縮，在實(shí)驗(yàn)中選用OL1812C-47P 7885269和DK18120-47P 7885249兩種納濾膜（膜的截留分子量分別為250Da和200Da）來進(jìn)行脫氨和濃縮研究。

2.4.1 250Da和200Da兩種膜組件納濾脫氨性能的比較

取脫色液5L（新霉素含量126.8 mg?ml-1、pH 10.5 、NH4OH濃度3%），啟動(dòng)納濾裝置，操作壓力2.5MPa，溫度30℃。實(shí)驗(yàn)過程中每5min測定回流罐中濃縮液的pH值。待回流罐中濃縮液體小于1.5L時(shí)，加水4L，重復(fù)操作。結(jié)果見表4。

表4 不同截留分子量膜組件納濾脫氨效果比較

從上表可以看出，雖然250 Da納濾膜的脫氨速度較快，90min后就后PH值就降到9.20，但新霉素?fù)p失率較高（達(dá)12.5%），對比結(jié)果我們選擇200Da納濾膜進(jìn)行脫氨濃縮處理的后續(xù)研究。

2.4.2 200Da膜脫氨效果的研究

實(shí)驗(yàn)表明，pH隨著處理時(shí)間的延長基本上是勻速降低，速度約為每5min降低0.05單位（如圖3）。氨水濃度的高低對于脫氨效率和脫氨時(shí)間的長短并無太大的影響。說明分子量200Da 的DK18120-47P 7885249膜組件能夠很好地除去洗脫液中的氨。

2.4.3 濃縮效果的研究

本工作考察了納濾裝置能夠進(jìn)行多大程度的濃縮以及所需濃縮時(shí)間的長短。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4。

從圖4可看出，在15～35min期間濃縮液的效價(jià)上升最快，到后期35min以后，由于濃縮液濃度較大，導(dǎo)致流通量減小，使得濃縮速度降低。在本實(shí)驗(yàn)中，約4×104 u?ml-1的物料經(jīng)40min處理可濃縮4倍，含新霉素16×104 u?ml-1的物料就可以直接用于噴霧干燥。說明納濾裝置能較好地滿足新霉素濃縮的需要。

圖3 3%氨水脫氨效果

圖4 200Da卷式膜濃縮效果

2.4.4 膜的流通量變化情況

隨著料液的不斷循環(huán)，料液濃度增加必然會影響到納濾膜的流通性能，本實(shí)驗(yàn)考察了流通量的變化情況以及這種變化是否具有可逆性，結(jié)果如圖5所示。

圖5 200Da納濾膜的流通量變化

在濃縮過程中，隨著操作時(shí)間的延長,膜上新霉素的濃度不斷增加,濃差極化也隨之嚴(yán)重,同時(shí)由于料液濃度的增加，導(dǎo)致納濾膜的流通量會顯著降低，在30min后流通量由開始的250ml/min下降到50ml/min,但加入4L水對料液進(jìn)行稀釋后，膜的流通速率迅速恢復(fù)到原有水平。說明這一過程是可逆，本實(shí)驗(yàn)中未觀察到納濾膜的流通堵塞現(xiàn)象,說明該方法能夠很好地用于新霉素的脫氨和濃縮。

2.5 新霉素的總回收率計(jì)算

3 結(jié)論

1.本工作研究了新霉素的新型提取純化技術(shù)，對3個(gè)重要單元操作過程進(jìn)行了優(yōu)化。新的技術(shù)集成（動(dòng)態(tài)732樹脂吸附àLSA—700樹脂脫色à200Da納濾膜處理）有利于提高新霉素的提取率和降低污染物的排放量。

2.采用壓濾方法對發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理，濾液再用732樹脂動(dòng)態(tài)吸附和動(dòng)態(tài)洗脫，新霉素的交換量可以達(dá)到142.9 mg?ml-1樹脂，洗脫收率高于96％，同時(shí)大大減少了工藝水的用量。LSA—700樹脂脫色比原來711脫色效果更好，洗脫回收率達(dá)92.1%色素OD值為0.38。

3.分子量200Da 的DK18120-47P 7885249納濾膜處理可有效地去除物料中的NH4OH，同時(shí)可有效地脫水濃縮，經(jīng)濃縮的物料可直接用于噴霧干燥或用于結(jié)晶。納濾操作中新霉素的收率高于99.4％，副產(chǎn)物氨水可回收利用。

4.優(yōu)化后的提取工藝新霉素提取率達(dá)88.2%，高于原來工廠的75%，說明本方法能夠很好地應(yīng)用于新霉素發(fā)酵液的提取。

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Studies on optimization of neomycin fermentation liquid extraction process

QIU Xiao-ming

（Foods and biology engineering department, Zhangzhou Institute of Technology,Fujian Zhangzhou 363000，China）

Because neomycin is sensitive to heat, the extraction rate of the existing extraction technology by applying the evaporation deamination and concentration is only 75%. The residual neomycin is discharged as wastewater increasing pollutant discharge. Through the improved process using dynamic adsorption and elution of 732 resin in this study, the exchange capacity of neomycin is 142.9 mg per ml resin, the elution yield is higher than 96%, while reducing water consumption. The decoloration effect of LSA - 700 resin is better than 711 resin, whose neomycin recovery rate reaches 92.1% and pigment OD value is 0.38. Finally, the NH4OH in materials can be effectively removed by nanofiltration membrane of 200Da, the neomycin yield is higher than 99.4%, and the by-product ammonia can be recycled. After the optimization, the neomycin extraction rate is 88.2%, higher than the existing level, showing this process can be well applied to neomycin extraction.

Neomycin；fermentation liquid；extraction；Nanofiltration

TQ465

A

1673-1417（2013）01-0021-06

2012－12－20

漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院科技資助項(xiàng)目(ZZY113)

邱小明（1979－），男，江西贛州人，講師，碩士研究生，研究方向：生物化工與生物制藥工程

（責(zé)任編輯：季 平）