卵子玻璃化冷凍技術(shù)在IVF-ET中的應(yīng)用(附7 例報告)

王長華，朱元，伍瓊芳，辛才林，趙琰

(江西省婦幼保健院生殖中心，南昌330006)

自1986 年澳大利亞Chen[1]首次報道用冷凍卵子進行體外受精(IVF)并成功妊娠后,玻璃化凍融技術(shù)及胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI) 很大程度上為卵子冷凍解決了困難, 大大提高了冷凍卵子的復(fù)蘇率及受精率。 胚胎的玻璃化冷凍技術(shù)已經(jīng)很成熟[2,3]，而卵子的玻璃化冷凍還在摸索階段。實際上卵子冷凍比胚胎冷凍有更廣泛的應(yīng)用前景。 卵子冷凍為建立卵子庫提供可行性, 可有效儲備婦女生育力, 對于因卵巢功能早衰、盆腔疾病、手術(shù)或放、化療等而可能喪失卵巢功能的女性是保存其生育力的一種手段。 此外, 卵子冷凍可緩解胚胎冷凍面臨的倫理、法律、道德、宗教等多方面問題。 建立卵母細胞庫,為少卵、無卵、卵巢早衰等婦女提供卵子等[4-6], 是生殖領(lǐng)域的研究熱點。尤其在IVF-ET 中，面對未預(yù)期的取精失敗、睪丸活檢無精子,發(fā)生在經(jīng)促超排卵已采集到卵母細胞時， 冷凍卵母細胞可作為一種補救手段。 現(xiàn)回顧性分析2011 年1 月-2012 年12 月體外受精周期中16 對不孕不育夫婦因取卵日男方未預(yù)期的取精失敗、 睪丸取精失敗或者男方無法到場等各種原因無法行體外受精而接受卵子冷凍的周期。 及其中7 對不孕不育夫婦隨后行卵子解凍及ICSI-ET 周期的胚胎發(fā)育及臨床結(jié)局， 從而探討卵子玻璃化冷凍技術(shù)在體外受精周期中臨床應(yīng)用的可行性。

1 資料和方法

1.1 研究對象 江西省婦幼保健院生殖中心2011年1 月-2012 年12 月實施體外受精-胚胎移植周期(in vitro fertilization-embryo transfer, IVF-ET)取卵日因男方取精困難行睪丸取精失敗或者男方無法到場等各種原因無法行體外受精而接受卵子冷凍的16 對不孕癥夫婦。凍卵者臨床資料：女性年齡24-41(31.9±5.7)歲,不孕年限(4.5±3.1)年。 月經(jīng)第3d FSH 值為(9.2±11.9) IU/L, LH 為(4.2±1.9) IU/L,E2為(43.8±19.5) pg/L。

1.2 超長方案 于月經(jīng)第2d 肌肉注射長效達菲林(天津-益普生公司,下同)3.75mg, 28-35d 后，達到降調(diào)標準后啟動GN 治療(果納芬，默克雪蘭諾)，啟始劑量為75-112.5U， 視卵巢反應(yīng)調(diào)整GN 量，直至HCG 注射日止。

1.3 常規(guī)長方案 患者于黃體中期監(jiān)測排卵后7d根據(jù)基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)及基礎(chǔ)內(nèi)分泌水平給予長效達菲林1.1-1.25mg 單次肌肉注射或達必佳0.1mg/d皮下注射進行垂體降調(diào)節(jié); 排卵障礙者于月經(jīng)第3d 始給予媽富隆(每片含去氧孕烯0.15mg、炔雌醇0.03mg,荷蘭歐加儂)1 片/d, 16d 后根據(jù)卵巢儲備情況用同樣方法降調(diào)。 于月經(jīng)第3d 行B 超及內(nèi)分泌檢查,若垂體完全降調(diào)節(jié),根據(jù)患者年齡、BMI、卵巢儲備、 前次卵巢反應(yīng)情況給予適當劑量FSH 啟動超排卵治療, 必要時聯(lián)用HMG, 直至HCG 注射日止。

患者于啟用Gn5d 后每日或隔日行陰式B 超檢查監(jiān)測卵泡發(fā)育情況,同時監(jiān)測血清LH、E2及P水平, 當至少有1 個卵泡直徑≥20mm 或2 個卵泡直徑≥19mm 時于當晚給予HCG(艾澤,瑞士雪蘭諾公司)250μg 皮下注射, 36h 后在陰道B 超引導(dǎo)下取卵。

1.4 經(jīng)皮睪丸精子抽吸術(shù)(testicular sperm aspiration,TESA)+開放性睪丸精子分離術(shù)(testicular sperm extraction,TESE) 術(shù)前簽署知情同意書。2%利多卡因7ml 行精索浸潤局部麻醉,如TESA 取精失敗,再行TESE。 具體步驟如下：術(shù)者一手緊握固定睪丸,切開陰囊各層,隨機選擇不同部位黃色飽滿的曲細精管,若獲取組織不理想,可剖開睪丸內(nèi)組織,但深度不超過0.5cm。分離組織后倒置顯微鏡下觀察,如無精子同法采取對側(cè)。 雙側(cè)均不能采到精子時,應(yīng)留取組織標本,日后觀察組織學(xué)改變。 以1 號絲線間斷縫合,術(shù)后應(yīng)用抗生素。 簽署凍卵知情同意書(包括可能出現(xiàn)的低存活、低受精及低妊娠率等風(fēng)險)。

1.5 卵子玻璃化冷凍及解凍 卵子冷凍在取卵后2 h 進行, 將卵冠丘復(fù)合物(cumulus-ocyte complexs,COCs)經(jīng)60IU/ml 透明質(zhì)酸酶(Sigma 公司)40 s 去除顆粒細胞。 卵子玻璃化冷凍：采用vitrolife 玻璃化冷凍試劑盒行玻璃化冷凍。 準備1 個四孔板，按順序每孔加入0.5ml 冷凍1 液、冷凍2 液、冷凍3 液，并將盛有冷凍液的四孔板預(yù)熱至37℃。 整個冷凍過程在37℃的熱臺上進行。 先將卵子置入冷凍1 液5-10min, 再轉(zhuǎn)入冷凍2 液2min， 在冷凍2液中卵子會漂浮起來，反復(fù)吹打讓其盡快沉下去。在冷凍2 液中還剩10s 時，開始將卵子轉(zhuǎn)入冷凍3液，30s 內(nèi)將卵子載入冷凍麥管并浸入液氮。 卵子玻璃化解凍：采用vitrolife 玻璃化解凍試劑盒行玻璃化解凍。 準備1 個四孔板，按順序每孔加入1ml解凍1 液、解凍2 液、解凍3 液和解凍4 液，并將盛有解凍液的四孔板預(yù)熱至37℃。 整個解凍過程在37℃的熱臺上進行。 將載有卵子的麥管從液氮中取出后快速將卵子置入解凍1 液，30s 內(nèi)用吸管抓取卵子并轉(zhuǎn)入解凍2 液，放置1min 后轉(zhuǎn)入解凍3 液，放置2min 后轉(zhuǎn)入解凍4 液，并在4 液中平衡5min。

1.6 體外受精及胚胎移植 以有正常細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)、透明帶完整、卵周間隙小為卵子存活標志。孵育2h后倒置顯微鏡下觀察。 僅將有明顯第一極體的成熟卵子行ICSI 受精, 16-18h 后觀察受精;以出現(xiàn)雌雄原核(2 pronucleus, 2PN)為正常受精標志。 隨后將正常受精的卵子轉(zhuǎn)移到專用的卵裂培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)約48h、72h 時均顯微鏡下觀察胚胎。 72h時細胞數(shù)在7－9 個細胞之間，卵裂速度正常、卵裂球大小均一或大致均一、碎片≤20%、胞漿飽滿,質(zhì)地均勻或大致均勻的胚胎定為優(yōu)質(zhì)胚胎， 挑選優(yōu)質(zhì)胚胎2-3 枚移植，剩余有價值胚胎冷凍，沒有冷凍價值的胚胎行囊胚培養(yǎng)， 養(yǎng)成的有價值的囊胚行玻璃化冷凍。 移植后14d 測尿和血清HCG 陽性為生化妊娠, 35dB 超檢查妊娠囊和胎心搏動情況,確定臨床妊娠。

1.7 實驗數(shù)據(jù)計算標準 存活率=存活卵子數(shù)/冷凍卵子數(shù)×100%; 正常受精率=2PN 卵子數(shù)/成熟卵子數(shù)×100%; 優(yōu)胚率=優(yōu)胚數(shù)/正常受精卵卵裂總數(shù)×100%;種植率=孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%;移植周期率=移植周期數(shù)/解凍周期數(shù)×100%;臨床妊娠率=妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%。 計量資料以(±s)表示,計數(shù)資料以率(%)表示。

2 結(jié)果

2.1 卵子復(fù)蘇后的臨床結(jié)局 16 例患者接受卵子冷凍，共冷凍卵子167 枚，7 例患者接受卵子解凍，共解凍卵子86 枚， 其中存活66 枚, 存活率為76.7%(66/86);其中66 枚成熟卵子行ICSI 受精，正常受精率為68.2%(45/66),卵裂率為91.1%(41/45)，優(yōu)質(zhì)胚胎率為14.6%(6/41);1 例患者因胚胎差取消移植，12 枚胚胎移植給6 例患者, 平均移植胚胎數(shù)為(2.0±0.6)個。 (見表1)。 種植率為16.7%(2/12)。 3 例患者生化妊娠，生化妊娠率為50%(3/6)2 例患者獲得了臨床妊娠,臨床妊娠率為33.3% (2/6)，其中1例患者已足月順利分娩1 女嬰, 體重為3.15kg，發(fā)育均正常，另1 例孕中期流產(chǎn)。

2.2 胎兒出生情況 2 例患者獲得了臨床妊娠,均為宮內(nèi)單活胎，其中1 例患者孕39+5周順利分娩1女嬰,體重為3.15kg，發(fā)育均正常，另1 例患者孕中期自然流產(chǎn)。

表1 卵子凍融后ICSI-ET的受精、胚胎及妊娠情況(n)

3 討論

在輔助生育技術(shù)中,未預(yù)期的取精失敗、睪丸活檢無精子,發(fā)生在經(jīng)促超排卵已采集到卵母細胞時,冷凍卵母細胞可作為一種補救手段。 人卵母細胞由于體積大,胞質(zhì)內(nèi)精細的結(jié)構(gòu),特別是紡錘體對冷凍敏感,冷凍后透明帶硬化將影響精子穿入等因素,因不同于胚胎及精子而凍融困難。 玻璃化冷凍采用高濃度的細胞內(nèi)冷凍保護劑,使細胞迅速脫水, 投入液氮后使細胞內(nèi)物質(zhì)形成透明玻璃樣狀態(tài), 避免慢速冷凍過程中冰晶形成所引起的損傷,可提高卵母細胞冷凍存活率。 穩(wěn)定成熟的卵子冷凍技術(shù)是臨床應(yīng)用的前提。

近年來卵子玻璃化冷凍獲得了較好的妊娠結(jié)局, 已有若干妊娠胎兒出生的報道[7-9], 但是其臨床應(yīng)用國內(nèi)外報道有限, 臨床可行性尚需大樣本證實。 本文中16 例患者接受卵子冷凍，共冷凍卵子167 枚，7 例患者接受卵子解凍， 共解凍卵子86枚，其中存活66 枚,存活率為76.7%;其中66 枚成熟卵子行ICSI 受精，正常受精率為68.2%,卵裂率為91.1%，優(yōu)質(zhì)胚胎率為14.6%;1 平均移植胚胎數(shù)為(2.0±0.6)個。 種植率為16.7% 。 3 例患者生化妊娠， 生化妊娠率為50%2 例患者獲得了臨床妊娠,臨床妊娠率為33.3% (2/6)，其中1 例患者已足月順利分娩1 女嬰，另1 例孕中期流產(chǎn)。 取得了較好的解凍復(fù)蘇率及臨床妊娠率， 與文獻報道的冷凍卵子和新鮮精子受精的結(jié)果一致[10]。本研究表明我中心卵子冷凍技術(shù)成熟穩(wěn)定， 可以較好的在臨床應(yīng)用， 卵子解凍后行ICSI 可以作為未預(yù)期的取精困難、 睪丸取精失敗及其他原因取卵日男方不能到場患者的一種臨床補救措施。 隨著科學(xué)發(fā)展,通過卵子冷凍技術(shù)及卵子庫的建立,使用女性生殖能力的儲備成為可能。

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