升結(jié)腸支架置入腹膜炎膿毒癥模型的應(yīng)用研究

陳海鳴，李學(xué)明，劉志堅(jiān)，鄒俊，李江濤，王聯(lián)群

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科，南昌330006)

膿毒癥(sepsis)是外科極為常見(jiàn)的一種疾病，無(wú)論在發(fā)達(dá)國(guó)家還是發(fā)展中國(guó)家都是最常見(jiàn)的。 膿毒癥病情兇險(xiǎn)，病死率高，治療成本高昂，發(fā)病率為每年70-240 人/10 萬(wàn)[1，2]，且呈逐年增長(zhǎng)，估計(jì)到2020 年將新增約100 萬(wàn)膿毒癥病例[3，4]。 膿毒癥的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜， 構(gòu)建出理想的臨床相關(guān)性膿毒癥模型也就一直成為膿毒癥研究的難點(diǎn)[5-7]。 本研究采用升結(jié)腸支架置入腹膜炎(colon ascendens stent peritonitis，CASP)模型，為研究膿毒癥的發(fā)病機(jī)制提供理想的動(dòng)物模型。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康清潔級(jí)Balb/c 雄性小鼠共60 只，6-8 周齡，體重23-27 g/只，實(shí)驗(yàn)前所有小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周以適應(yīng)環(huán)境。實(shí)驗(yàn)小鼠分5組，正常對(duì)照組，假CASP 組，CASP 組，其中CASP組按照支架的直徑不同分為3 組：CASP 14GA 組[BD14GA(2.0×45mm2, 270 ml/min)]，CASP 16GA 組[BD16GA(1.7×45mm2, 180 ml/min)]，CASP 18GA 組[BD18GA(1.2×45mm2, 80 ml/min)]，每組動(dòng)物12 只。

1.2 CASP 模型的制作 3 組CASP 模型分別采用靜脈輸液的18GA、16GA 和14GA3 種規(guī)格BD 針做插管支架， 從尖端環(huán)形切掉塑料圓管2mm 距離切端1cm 處用剪刀壓榨一小溝， 但不切破塑料壁管壁備用。 抽取20 g/L 戊巴比妥鈉，按50mg/kg 進(jìn)行小鼠腹腔麻醉，沿腹中線切開(kāi)腹腔，用棉簽仔細(xì)地將盲腸、末端回腸、升結(jié)腸從腹腔輕輕拔出，距盲腸末端15mm， 用BD 針支架離4-0 薇喬線1-2mm 戳穿升結(jié)腸并進(jìn)入結(jié)腸1cm， 用4-0 薇喬線縫合固定在升結(jié)腸腸壁上， 用棉簽朝著塑料支架仔細(xì)擠出腸內(nèi)容物， 直到支架的末端有一點(diǎn)糞便流出，把內(nèi)臟放回腹腔，腹腔給予37℃的0.5ml 生理鹽水復(fù)蘇，關(guān)閉腹膜、皮膚。假CASP 組將塑料支架用縫線固定在升結(jié)腸系膜后將結(jié)腸回納入腹腔，其余手術(shù)過(guò)程同CASP 組。 正常對(duì)照組為不做任何操作組。

1.3 觀察指標(biāo) (1)術(shù)后一般表現(xiàn)；(2)不同管徑支架的CASP 模型的生存時(shí)間及生存率；(3)各器官HE染色行組織病理學(xué)的檢測(cè)；(4) 腹腔分泌物微生物實(shí)驗(yàn)室檢查。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS15.0 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，應(yīng)用Kaplan-Meier 方法和Log-rank 檢驗(yàn)評(píng)價(jià)各小組生存率，P<0.05 為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)后一般表現(xiàn) 12h 后CASP 各組均逐漸出現(xiàn)豎毛、蜷縮、少動(dòng)、少食、呼吸減弱、體溫下降，嚴(yán)重者可見(jiàn)眼角分泌物較多及顫抖， 但CASP18GA 組的癥狀出現(xiàn)時(shí)間最晚，癥狀最輕， CASP16GA 組的癥狀出現(xiàn)時(shí)間其次， 癥狀較重，CASP14GA 組的癥狀出現(xiàn)時(shí)間最早，癥狀最重。

2.2 不同管徑支架的CASP 模型的生存時(shí)間 術(shù)后18h 開(kāi)始觀察到小鼠死亡，CASP 各組小鼠的生存時(shí)間取決于置入支架的管徑， 置入支架管徑越小生存時(shí)間越長(zhǎng)， 其中CASP14GA 組小鼠平均存活時(shí)間為(28.800±2.752)h，CASP16GA 組小鼠平均存活時(shí)間為(84.200±21.758)h，CASP18GA 組小鼠平均存活時(shí)間為(113.200±21.270)h。 應(yīng)用Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行生存分析顯示不同管徑CASP 實(shí)驗(yàn)組間有 顯 著 性 差 異 (n=10，P=0.009，χ2=9.531)，CASP 14GA 組、CASP16GA 組、CASP18GA 組與假CASP組和正常對(duì)照組有顯著性差異(n=10，P<0.001，χ2=74.524)。 見(jiàn)表1。

表13 種管徑支架的CASP模型的生存時(shí)間比較

2.3 CASP 實(shí)驗(yàn)組各器官HE 染色 (1)肺臟：CASP實(shí)驗(yàn)組肺間隔明顯增寬，肺泡壁小血管擴(kuò)張充血，多灶出血，炎細(xì)胞浸潤(rùn)；(2)肝臟：肝臟匯管區(qū)增寬，小葉間血管擴(kuò)張，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；(3)腸：CASP 實(shí)驗(yàn)組小腸粘膜可見(jiàn)回腸黏膜糜爛壞死， 腸腔內(nèi)大量的炎性滲出物和脫落壞死的腸黏膜上皮， 絨毛明顯萎縮，間質(zhì)血管擴(kuò)張，大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；(4)腎臟：腎小球毛細(xì)血管袢擴(kuò)張充血，球囊腔狹窄。腎小管上皮細(xì)胞空泡及顆粒變性。 腎間質(zhì)水腫，血管擴(kuò)張充血；(5)脾臟：脾竇增寬，擴(kuò)張充血，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，局部灶性出血。 白髓淋巴組織增生，淋巴濾泡形成；(6)心臟：心肌片狀水腫，心臟間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)血管充血。

2.4 腹腔分泌物微生物實(shí)驗(yàn)室檢查 假CASP 組、正常對(duì)照組均未檢測(cè)到細(xì)菌生長(zhǎng)，CASP 實(shí)驗(yàn)組腹腔內(nèi)分泌物培養(yǎng)均檢測(cè)到典型的腸道細(xì)菌如革蘭陰性大腸埃希氏菌、桿菌種、腸球菌等。

3 討論

盡管近十年來(lái)膿毒癥實(shí)驗(yàn)與臨床研究方興未艾，但膿毒癥的致病機(jī)制仍未闡明[5，7]。 膿毒癥的動(dòng)物模型的構(gòu)建大大促進(jìn)了人們對(duì)膿毒癥發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)。 其中盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)模型(cecal ligationperforation，CLP) 被認(rèn)為是進(jìn)行膿毒癥研究的金標(biāo)準(zhǔn)[8-9]。 自1978 年以來(lái)得到廣泛的應(yīng)用，然而研究發(fā)現(xiàn)該模型仍具有自身的缺陷， 主要表現(xiàn)為CLP模型在穿孔后包裹感染灶，使得感染局限化，有的甚至完全恢復(fù)， 從而不會(huì)進(jìn)展到膿毒癥及膿毒癥休克。 為此，本研究采用升結(jié)腸支架置入至腹膜炎的膿毒癥動(dòng)物模型。

CASP 模型構(gòu)建是將一個(gè)固定管徑的支架植入鼠的升結(jié)腸， 使糞便持續(xù)滲漏到腹膜腔中并形成腸道細(xì)菌感染，導(dǎo)致腹腔膿腫和彌漫性腹膜炎，病理變化與臨床上腸瘺的病理變化過(guò)程相似，都是破壞宿主屏障， 造成細(xì)菌易位， 引發(fā)炎癥的模型。 本研究分別采用3 種不同管徑的支架構(gòu)建CASP 模型，小鼠均表現(xiàn)明顯的膿毒癥及膿毒性休克的癥狀，出現(xiàn)豎毛、蜷縮、呼吸減弱、體溫下降等癥狀，小鼠腹腔有明顯的炎癥征象，小腸部分壞死發(fā)黑，腹腔炎癥嚴(yán)重，明顯滲液，腹腔內(nèi)分泌物培養(yǎng)出腸道細(xì)菌， 進(jìn)一步組織病理切片結(jié)果顯示小腸黏膜明顯壞死脫落，絨毛萎縮，心、肺、腎、脾臟有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等炎癥表現(xiàn)，CASP 模型各組小鼠的生存時(shí)間及炎癥程度取決于置入支架的直徑， 支架直徑越大炎癥越重。 本研究結(jié)果顯示CASP 模型可以彌補(bǔ)CLP 模型持續(xù)性腹腔內(nèi)感染不足的缺點(diǎn)，重現(xiàn)了急性多細(xì)菌性膿毒癥腹膜炎的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，對(duì)于探討膿毒癥的病理生理學(xué)及機(jī)制的研究無(wú)疑具有重要意義。 本實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，具有可重復(fù)性，可以模仿人類(lèi)彌漫性腹膜炎疾病過(guò)程， 適用于外科膿毒癥的研究。

[1]Martin GS, Mannino DM, Eaton S, et al.The epidemiology of sepsis in the United States from 1979 through 2000 [J]. N Engl J Med,2003, 348(16)：1546-1554.

[2]Finfer S, Bellomo R, Lipman J, et al. Adult population incidence of severe sepsis in Australian and New Zealand Intensive Care Units[J]. Intensive Care Med, 2004, 30(4)：589-596.

[3]Angus DC, Linde-Zwirble WT, Lidicker J, et al. Epidemiology of severe sepsis in the United States： Analysis of incidence, outcome,and associated costs of care[J]. Crit Care Med, 2001, 29(7)：1303-1310.

[4]Dombrovskiy VY, Martin AA, Sunderram J, et al. Rapid increase in hospitalization and mortality rates for severe sepsis in the United States： Atrend analysisfrom1993 to 2003 [J]. Crit Care Med, 2007,35(5)：1244-1250.

[5]陳海鳴.高容量血液濾過(guò)對(duì)外科膿毒癥的治療研究[J].江西醫(yī)藥，2009,44(10)：1-3.

[6]王聯(lián)群.免疫營(yíng)養(yǎng)對(duì)外科膿毒癥的治療研究[J]. 江西醫(yī)藥，2008,43(1)：1005-1006.

[7]Robinson K, Kruger P, Prins J, et al. The metabolic syndrome in critically ill patients [J]. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab.2011, 25(5)：835-845.

[8]陳海鳴,李學(xué)明.膿毒癥動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ脱芯窟M(jìn)展[J]. 江西醫(yī)藥，2012,47(10)：937-939.

[9]Zanotti SL, Guglielmi M, Parrillo JE, et al. Fluid resuscitation influences cardiovascular performance and mortality in a murine model of sepsis[J]. Intensive Care Med,2009,35(4),748-754.