多種酶復合制備雞皮膠原蛋白短肽

曾慶冉， 張 慜*， 陳世豪

（1.江南大學 食品學院，江蘇 無錫214122；2.廣東嘉豪食品股份有限公司，廣東 中山 528447）

膠原蛋白是哺乳動物體內(nèi)含量最豐富、分布較廣的蛋白質(zhì)之一，其應(yīng)用領(lǐng)域包括生醫(yī)材料、化妝品、食品工業(yè)等[1]。對于人體，膠原蛋白的作用可以說毋庸置疑，無論是對于美容保養(yǎng)還是生命健康，膠原蛋白都發(fā)揮著重要作用。然而，由于膠原蛋白屬大分子級別的蛋白質(zhì)，具有十分穩(wěn)定的三股超螺旋結(jié)構(gòu)，從而造成其消化困難，不易被人體充分利用。研究表明，大量氨基酸是以2～6個氨基酸組成的寡肽形式被吸收，寡肽有助于腸道吸收。在氨基酸運輸系統(tǒng)功能出現(xiàn)障礙的情況下，攝入寡肽卻能獲得很好的吸收效果。因此需要將膠原蛋白水解為相對分子質(zhì)量較低的膠原短肽[2]。目前膠原蛋白水解方式分為酸法、堿法和酶法。而酶法水解比傳統(tǒng)的酸法、堿法水解更加溫和、安全、專一性強，并且時間短，無環(huán)境污染。

由于膠原蛋白多肽對增強防病抗病能力、延緩衰老等方面都具有深遠意義，目前，開發(fā)和研究生物活性肽類食品在國際保健品行業(yè)中已成為一個焦點。富含膠原蛋白最多的原料是豬皮、牛皮、豬骨頭和牛骨頭。Siriporn Damrongsakkul等用木瓜蛋白酶和中性蛋白酶水解牛皮提取膠原蛋白[3]，李興武、章黎黎等利用豬副產(chǎn)物酶法制備膠原多肽[4]。然而，由于人們對陸生哺乳動物膠原蛋白及其制品的安全性產(chǎn)生了質(zhì)疑，因此目前工作就是尋找新的提取膠原多肽的原料來源[5]。賈冬英等也首次嘗試從鰱魚頭及骨中提取膠原蛋白[6]。然而據(jù)了解，目前從雞皮等禽源性皮中提取膠原蛋白還未見過多報道，而雞肉在中國已成為僅次于豬肉的第二大肉類消費品。因此研究和開發(fā)從雞皮中提取膠原蛋白不僅可以充分利用雞皮資源，提高雞肉產(chǎn)品的附加值，還能保護環(huán)境，擴大膠原蛋白的原料來源，同時拓寬了膠原蛋白的應(yīng)用范圍。因此，作者以雞皮為原料，提取膠原蛋白多肽，旨在為進一步開發(fā)利用雞皮提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

雞皮:取自無錫歐尚超市童子雞。購買后清洗去皮，將雞皮瀝干后測其基本成分，結(jié)果見表1。

表1 原料的基本成分Table 1 Material's mainly composition

將瀝干后的雞皮用剪刀剪成小的正方形（1 cm×1 cm），然后將其放入自封袋中于-20℃冷凍保藏，保藏時間不能大于一個月。

1.2 試劑

胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶Flavourzyme、復合蛋白酶PROTAMEX、水解蛋白酶Novozym 37071:諾維信生物技術(shù)有限公司。SDSPAGE超低相對分子質(zhì)量標準品:上海源葉生物科技有限公司（相對分子質(zhì)量范圍3 313～20 100）；牛血清白蛋白、SDS、脲、過硫酸銨、丙烯酰胺、N，N'-甲叉雙丙烯酰胺、Tris、Tricine、TEMED、 氫氧化鈉、氯化鈉、正丁醇、鹽酸、濃硫酸、硼酸、硫酸鉀、硫酸銅、乙醚、三氯乙酸等試劑:均為分析純。

1.3 儀器與設(shè)備

實驗室pH計FE20:梅特勒-托利多儀器 （上海）有限公司；電子天平PL203:梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；CJJ78-1型磁力加熱攪拌器:金壇市大地自動化儀器廠；SIGMA2-16PK離心機:北京博勵行儀器有限公司；HH-S型水浴鍋:鄭州長城科工貿(mào)有限公司；UV-9100型紫外可見光譜儀:北京瑞麗產(chǎn)品；U410超低溫冰箱:New BRUNSWICK SCIENTIFIC CO.；冷凍干燥機:作者所在實驗室自行設(shè)計組裝；DYY-8C型電泳儀:北京市六一儀器廠；氨基酸自動分析儀。

1.4 實驗方法

1.4.1 原料預處理 由于雞皮中含有一定的脂肪和雜蛋白質(zhì)，因此在水解前需要去除雜蛋白質(zhì)和脂肪。取剪碎后的雞皮加入質(zhì)量濃度為10 g/dL的NaCl溶液中（料液比為 1∶10），4 ℃攪拌浸提 12 h去除雜蛋白質(zhì)，然后用蒸餾水反復清洗至pH值接近中性。用兩層紗布過濾后加入質(zhì)量濃度為10 g/dL的正丁醇溶液，4℃攪拌浸提24 h去除脂肪，用大量蒸餾水反復清洗得脫雜蛋白質(zhì)和脂肪的雞皮[7]。

1.4.2 雞皮膠原蛋白肽制備工藝 將預處理后的雞皮按料液比1∶10的比例加水，在一定條件下酶解，然后于85℃下滅酶10 min，滅酶后將酶解液迅速冷卻至適溫，經(jīng)4 000 r/min離心10 min，取上清液濃縮，冷凍干燥后即得雞皮膠原蛋白多肽[8-9]。

1.4.3 分析測定方法

1）水解度的測定:采用雙指示劑甲醛滴定法[10]。

2）多肽含量的測定:將5 mL 10%三氯乙酸溶液添加到5 mL待測樣品中，于旋渦混合儀上混合均勻，靜置10 min，在4 000 r/min下離心20 min，取上清液用雙縮脲法測可溶性氮含量[11]。

3）氨基酸含量及組成分析:準確量取5 mL膠原蛋白多肽溶液于水解管內(nèi)，并加入6 mol/L鹽酸10 mL，抽真空，封口，在110℃恒溫干燥箱內(nèi)水解24 h后取出。冷卻后將水解液過濾后轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶定容。吸取濾液1 mL于5 mL容量瓶內(nèi)，用真空干燥器在40～50℃干燥，最后蒸干，用1 mL pH 2.2的緩沖液溶解后用氨基酸自動分析儀分析測定[12]。

4)多肽相對分子質(zhì)量分布測定:用含脲的Tricine-SDS-PAGE 方法[13-15]。

聚丙烯酰胺凝膠制備見表2。先制備分離膠，聚合后再制備夾層膠，最后制備濃縮膠。三種膠長度比例 4∶1∶1.5。電泳時電壓為 30 V；1 h后變?yōu)?100 V至結(jié)束。將膠在固定液中（0.5%戊二醛、30%乙醇加ddH2O到100 mL）固定30 min，再用考馬斯亮藍G-250系統(tǒng)染色30 min，然后用脫色液脫色。

表2 聚丙烯酰胺凝膠配方Table 2 Polyacrylamide gel formula

2 結(jié)果與分析

2.1 酶種類的選擇

由于利用復合酶水解，提取率高且平均相對分子質(zhì)量較小，因此為了能夠得到較多相對分子質(zhì)量較小的多肽，選用三種酶復合對雞皮水解。選擇比較了胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶Flavourzyme、復合蛋白酶PROTAMEX、水解蛋白酶Novozym 37071的水解效果，以及兩個酶復合的水解效果，從而選用1（木瓜蛋白酶+胰蛋白酶+復合蛋白酶）、2（木瓜蛋白酶+胰蛋白酶+風味蛋白酶）、3（木瓜蛋白酶+風味蛋白酶+復合蛋白酶）、4（Novozym37071蛋白酶+木瓜蛋白酶+風味蛋白酶）、5（胰蛋白酶+風味蛋白酶+復合蛋白酶）按 1∶1∶1 對雞皮水解。取一定量預處理的雞皮，按料液比1∶10加入蒸餾水，按雞皮質(zhì)量的1%加入復合酶，在50℃下酶解 3 h，滅活、離心、冷凍干燥，結(jié)果見圖1。由圖1可知，利用2（木瓜蛋白酶+胰蛋白酶+風味蛋白酶）復合水解，在相同條件下，水解度和多肽含量最高，故采用木瓜蛋白酶+胰蛋白酶+風味蛋白酶1∶1∶1復合水解。

圖1 酶的種類對多肽水解效果的影響Fig.1 Effects of enzymatic types on peptide hydrolysis

2.2 pH值的影響

取一定量的雞皮，按1∶10的料液比加入蒸餾水，按雞皮質(zhì)量的1%加入復合酶，在50℃，分別于pH 5～8.5下酶解3 h，考察pH值對肽水解效果的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可知，在pH 5～8.5范圍內(nèi)，隨著pH的變化，水解度和多肽質(zhì)量濃度均有所不同，其中在pH 7時，多肽質(zhì)量濃度最高，水解度較高；在pH 7.5時水解度最高，而多肽質(zhì)量濃度有所下降，但下降不是很多。說明在pH 7～7.5時，復合酶的活性和穩(wěn)定性最好，因此最適酶解pH為7～7.5。

圖2 pH值對多肽水解效果的影響Fig.2 Effects of pH on peptide hydrolysis

2.3 酶解時間的確定

取一定量的雞皮，按1∶10的料液比加入蒸餾水，調(diào)節(jié)pH值至7左右，按雞皮質(zhì)量的1%加入復合酶，在50℃下進行水解，分別酶解不同時間后，滅酶、離心、冷凍干燥?？疾烀附鈺r間對肽水解效果的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知，隨著酶解時間的延長，水解度和多肽質(zhì)量濃度也呈上升趨勢，但3 h后水解度上升趨勢減弱，且多肽質(zhì)量濃度出現(xiàn)下降，這可能是由于多肽進一步水解為氨基酸的原因[16]。因此，在對相對分子質(zhì)量大小影響不大的前提下，為了獲得較多多肽，初步確定酶解時間為3 h。

圖3 酶解時間對多肽水解效果的影響Fig.3 Effects of hydrolysis time on peptide hydrolysis

2.4 加酶量的確定

取一定量的雞皮，按1∶10的料液比加入蒸餾水，調(diào)節(jié)pH值至7左右，按雞皮質(zhì)量的不同百分比加入復合酶，在50℃下酶解3 h，滅酶、離心、冷凍干燥?？疾旒用噶繉Χ嚯乃庑Ч挠绊?，結(jié)果見圖4。由圖4可知，當加酶量較低時，水解度和多肽質(zhì)量濃度會隨加酶量的增加而快速上升，當加酶量為0.8%時，多肽質(zhì)量濃度最大，但是當加酶量大于0.8%時，多肽質(zhì)量濃度會隨加酶量的增加而減少，而水解度也沒用明顯變化，這是因為當酶的濃度相對于底物濃度較低時，加大酶的用量可以有效加快酶解反應(yīng)速度，但是當酶的濃度相對于底物濃度較高時，反應(yīng)速率開始由底物濃度控制，所以繼續(xù)增加酶的用量對水解度的影響不大。而相反，由于酶的濃度相對較大，從而使一部分多肽進一步水解為氨基酸，從而使多肽質(zhì)量濃度降低。所以最適的加酶量為雞皮質(zhì)量的0.8%。

圖4 加酶量對水解效果的影響Fig.4 Effectsofenzymeconcentrationson peptide hydrolysis

2.5 酶解溫度的確定

取一定量的雞皮，按1∶10的料液比加入蒸餾水，調(diào)節(jié)pH值至7左右，按雞皮質(zhì)量的0.8%加入復合酶，在不同溫度下，酶解3 h，滅酶、離心、冷凍干燥。考察溫度對多肽水解效果的影響，結(jié)果見圖5。溫度對雞皮水解反應(yīng)影響較大，在35～50℃時，水解度隨著溫度升高不斷增大，多肽質(zhì)量濃度也不斷增加，在50℃時達到最大，當溫度高于50℃時水解度開始下降，多肽質(zhì)量濃度降低。這是因為溫度對酶解反應(yīng)速度具有雙重影響，升高溫度可加快酶解反應(yīng)速度，同時當溫度過高時，酶容易變性，酶活力容易降低，故采用溫度為50℃進行酶解。

圖5 酶解溫度對多肽水解效果的影響Fig.5 Effects of hydrolysis temperature on peptide hydrolysis

2.6 最佳酶解條件的確定

在初步確定酶解條件的基礎(chǔ)上，選擇酶解時間、pH值、加酶量和溫度等因素，并以多肽質(zhì)量濃度為評判指標進行正交試驗，試驗安排及結(jié)果見表3。由表3可知，各因素對水解效果影響的順序為溫度＞加酶量＞酶解時間＞pH值，其最佳工藝組合為pH 7，溫度45℃，酶解時間3 h，加酶量0.9%。雞皮在該條件下酶解，其水解液中多肽質(zhì)量濃度最高，可達1.32 mg/mL。

2.7 雞皮膠原蛋白肽的理化分析

2.7.1 多肽氨基酸含量及組成分析 膠原蛋白多肽的氨基酸組成見表4。從表4可以看出，在雞皮膠原蛋白多肽中共含有18種氨基酸，其中甘氨酸所占比例最大，占21.63%，與脯氨酸比例約3∶1，復合膠原蛋白氨基酸的基本構(gòu)成。脯氨酸次之，約占13.17%，而羥脯氨酸是膠原蛋白特有的一種氨基酸，對于穩(wěn)定膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)起到一定作用。另外，從表4中還可以看出，膠原蛋白中不含色氨酸，幾乎不含半胱氨酸。說明酶解的膠原蛋白中幾乎不含其他型膠原蛋白質(zhì)。而苯丙氨酸、異亮氨酸、組氨酸的質(zhì)量分數(shù)較低，符合膠原蛋白質(zhì)的性質(zhì)[17]。

表3 優(yōu)化酶解條件正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Design and results of orthogonal experiment for optimization of hydrolysis conditions

2.7.2 多肽相對分子質(zhì)量測定 膠原蛋白多肽的SDS-PAGE電泳圖見圖6。M為超低相對分子質(zhì)量標準蛋白質(zhì)和多肽:從下至上分別是3 313、5 856、7 823、14 400、20 100。 Tricine-SDS-PAGE 結(jié)果顯示:位于5 856～20 100之間沒有明顯條帶，而在3 313～5 856之間有明顯的兩條帶，在3 313稍下部分有一條帶，說明酶解多肽的相對分子質(zhì)量主要集中在2 000～5 000之間。

表4 膠原蛋白多肽的氨基酸組成Table 4 Amino acid composition of collagen polypeptides

圖6 膠原蛋白多肽的SDS-PAGE電泳圖Fig.6 SDS-PAGE electrophoretogram ofcollagen polypeptide

3 結(jié)語

以雞皮為原料，采用酶水解法提取膠原蛋白多肽，并用正交實驗對膠原蛋白肽的提取工藝進行優(yōu)化，并測定了雞皮的基本組成成分和多肽的氨基酸組成相對分子質(zhì)量。結(jié)果表明，采用木瓜蛋白酶+胰蛋白酶+風味蛋白酶復合水解，當在pH為7，加酶量為0.9%，酶解溫度為45℃，酶解時間3 h時，水解度最好，多肽含量最大。

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