刺參26S蛋白酶體S7亞基基因的克隆與組織表達(dá)分析

趙祥吉，秦艷杰，李霞，劉洋，丁鑒峰

(1.大連海洋大學(xué)遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023;2.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023;3.江西省上饒市鄱陽中學(xué)，江西上饒 333100）

刺參26S蛋白酶體S7亞基基因的克隆與組織表達(dá)分析

趙祥吉1、3，秦艷杰1、2，李霞1，劉洋1，丁鑒峰1

(1.大連海洋大學(xué)遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023;2.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023;3.江西省上饒市鄱陽中學(xué)，江西上饒 333100）

應(yīng)用RACE法從刺參Apostichopus japonicus體腔細(xì)胞中克隆出26S蛋白酶體組成19S亞復(fù)合體亞基之一的S7亞基基因 (GenBank登錄號:JQ922514）。該基因的cDNA序列全長為2 445 bp，其中5'UTR為70 bp，3'UTR為1 070 bp，開放閱讀框?yàn)? 305 bp，編碼435個氨基酸;保守區(qū)具有典型的ATP結(jié)合和水解基序，氨基酸序列分別為GPPGTGKT和DEID，具有MAT和VRPGRLDR的RNA/DNA螺旋酶的特征性基序;刺參26S蛋白酶體S7亞基基因與紫海膽的氨基酸序列同源性最高 (95%），與脊椎動物、節(jié)肢動物的同源性較高 (88%～89%），與線蟲、擬南芥和酵母同源性較低 (85%、77%和73%）;S7亞基編碼的蛋白沒有信號肽，也沒有跨膜結(jié)構(gòu)域，為非跨膜蛋白，定位于細(xì)胞中的液態(tài)基質(zhì)中。采用實(shí)時定量PCR方法檢測了26S蛋白酶體S7亞基基因在刺參5種組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，在腸、呼吸樹、表皮、體腔細(xì)胞、縱肌中26S蛋白酶體S7基因均有明顯表達(dá)，且體腔細(xì)胞中表達(dá)量最高，其次是縱肌和腸，在體壁和呼吸樹中表達(dá)量較低。本研究中首次在刺參體內(nèi)發(fā)現(xiàn)并克隆了26S蛋白酶體S7亞基基因，同時采用Realtime PCR技術(shù)對該基因的表達(dá)部位進(jìn)行了研究，所得結(jié)果將為研究棘皮動物蛋白質(zhì)代謝途徑提供新的著眼點(diǎn)，為刺參生理功能的調(diào)控研究奠定了基礎(chǔ)。

刺參;26S蛋白酶體S7亞基;基因克隆;組織表達(dá)

在真核生物中，26S蛋白酶體 (26S proteasome，26S PSM）是一種依賴ATP的蛋白酶復(fù)合體，該蛋白酶體分子由催化顆粒 (Catalytic particle，CP，又稱 20S降解復(fù)合體）和調(diào)節(jié)顆粒(Regulatory particle，RP，又稱19S調(diào)節(jié)復(fù)合體）構(gòu)成，其中20S復(fù)合體具有蛋白質(zhì)水解功能，而19S調(diào)節(jié)復(fù)合體負(fù)責(zé)對蛋白質(zhì)底物的識別、去折疊和變性。哺乳動物19S調(diào)節(jié)復(fù)合體由至少20個亞基構(gòu)成，其中至少有6個具有ATPase酶活性的亞基 (包 括 S7、S4、S6b、S10b、S6a 和 S8）［1－2］，而S4、S6、S7、S8還可作為轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白等功能蛋白基因，參與細(xì)胞的程序性死亡［2－3］。26S蛋白酶體已在哺乳動物 (尤其是癌癥患者）、植物等的研究中成為熱點(diǎn)，這是因?yàn)樵摰鞍酌阁w能夠?qū)Χ喾N細(xì)胞活動進(jìn)行調(diào)控，調(diào)控機(jī)理是通過“泛肽 (Ubiquitin）依賴性蛋白降解途徑”對細(xì)胞內(nèi)的異常蛋白以及參與細(xì)胞周期、代謝調(diào)控等的功能蛋白進(jìn)行選擇性降解。在水產(chǎn)動物中僅見Horiguchi等［4］利用免疫印跡方法對金魚26S蛋白酶體α4亞基的磷酸化進(jìn)行了初步研究;姜鐵民等［5］對合浦珠母貝26S蛋白酶體S4、S7亞基基因的部分片段進(jìn)行了分離與分析。有關(guān)其他水產(chǎn)動物26S蛋白酶體的研究國內(nèi)外尚未見報道。

刺參Apostichopus japonicus又名仿刺參，隸屬于棘皮動物門、海參綱、刺參科、仿刺參屬，是中國黃渤海地區(qū)的主要養(yǎng)殖品種之一，經(jīng)濟(jì)價值較高。刺參的再生能力較強(qiáng)，近幾年關(guān)于其再生的生物學(xué)特征和分子機(jī)制等方面的研究已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)［6－7］，也為醫(yī)學(xué)研究提供了重要啟示。國內(nèi)對刺參再生的研究主要集中在其形態(tài)學(xué)、組織學(xué)等方面［8－9］，而對再生的分子機(jī)理探討則剛剛起步。周遵春等［10］構(gòu)建了刺參多個組織的全長cDNA文庫并進(jìn)行了EST初步分析;Sun等［11］對刺參再生的腸道和體壁進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序研究。李霞等［12］首次構(gòu)建了刺參體壁再生的差減文庫，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了再生相關(guān)基因的克隆研究。這些研究工作都為刺參功能基因的研究以及再生分子機(jī)理的探討奠定了基礎(chǔ)。作者在通過差減文庫研究刺參體壁再生的過程中，發(fā)現(xiàn)了刺參26S蛋白酶體S7亞基部分序列在刺參再生體壁中上調(diào)表達(dá)，由此首次克隆得到了該基因的全長，并進(jìn)行了該基因在刺參不同組織中的表達(dá)分析。鑒于S7亞基基因在哺乳動物和植物中調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面的重要作用，結(jié)合刺參具有超強(qiáng)再生能力的特點(diǎn)，本研究結(jié)果將有助于揭示刺參再生的分子機(jī)理，并將揭開棘皮動物蛋白質(zhì)降解途徑研究的序幕。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用刺參 (體長為6～8 cm）于2012年3月采自旅順龍王塘海區(qū)，暫養(yǎng)在大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室300 L的塑料水槽中，培育用水為沙濾海水，每天換水1/2，投喂人工配合餌料，水溫控制在 (18±1）℃，連續(xù)充氣，暫養(yǎng)1個月以上。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA合成 挑選健康刺參，用注射器抽取體腔液，將體腔液以4 500 r/min離心10 min，棄上清收集細(xì)胞，按照李霞等［12］的方法進(jìn)行RNA提取、純化和電泳檢測。將純化后的RNA于－80℃下保存?zhèn)溆谩０凑辗崔D(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司）說明書進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄。

1.2.2 RACE擴(kuò)增 由李霞等［12］構(gòu)建的刺參體壁再生差減文庫，得到一段長330 bp的序列，經(jīng)Blastx比對分析，發(fā)現(xiàn)該序列與26S蛋白酶體S7亞基基因的同源性較高。以此為目的片段，采用SMART RACE試劑盒 (Clontech公司）進(jìn)行基因全長的克隆，操作方法按照說明書進(jìn)行，其中涉及到的引物見表1。擴(kuò)增體系共25 μL，包括2.5 μL 10×PCR Buffer，2.0 μL MgCl2(25 mmol/L），2.0 μL dNTP Mixture(各 2.5 mmol/L），引物 UPM/NUP 2.5 μL，引物調(diào)節(jié)亞基3'或5'/調(diào)節(jié)亞基3'EN或 5'EN 1.0 μL，ddH2O 13.0 μL。PCR 反應(yīng)條件為:94℃下預(yù)變性5 min;94℃下變性30 s，51℃ (3'RACE）/55℃ (5'RACE）下退火30 s，72℃下延伸2 min，共進(jìn)行35個循環(huán);最后在72℃下延伸10 min。

取5 μL PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，采用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒 (TaKaRa公司）切膠回收產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物純化后連接到PMD19－T(TaKaRa公司）載體中，于16℃下連接過夜。將連接好的載體熱轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E.Coli DH5α(TaKaRa公司）中，并在涂有IPTG、Amp的平板上過夜培養(yǎng) (培養(yǎng)箱溫度為37℃），然后挑取藍(lán)菌加入到含有Amp的1 mL培養(yǎng)液中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。用引物Rv－m、M13－47(表1）對菌液進(jìn)行PCR檢測，并將檢測合格的菌液送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。

表1 試驗(yàn)引物序列Tab.1 Sequences of PCR primers in this study

1.2.3 生物信息學(xué)分析與系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建 用DNAStar軟件將S7亞基基因cDNA序列翻譯成氨基酸序列，并確定刺參26S蛋白酶體S7亞基基因的開放閱讀框;在Genbank數(shù)據(jù)庫中用Blastx程序進(jìn)行序列比對;采用 ProtParam、ProtScale、TMHMM Server 2.0軟件預(yù)測該基因編碼蛋白的理化性質(zhì)、親疏水性和跨膜結(jié)構(gòu)域;采用SingnalP 3.0 Server、ExPaSy－motifscan和 Interproscan軟件進(jìn)行motify區(qū)域和信號肽的預(yù)測。在www.predictprotein.org網(wǎng)頁上進(jìn)行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測。用Clustal W軟件將本研究中獲得的刺參26S蛋白酶體S7亞基基因序列與其他物種相應(yīng)序列進(jìn)行比對，并用Mega 5.0軟件繪制26S蛋白酶體S7亞基基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 26S蛋白酶體S7亞基基因在刺參5種組織中的表達(dá)檢測 隨機(jī)選取實(shí)驗(yàn)室培育的刺參5只，割取體壁并解剖，取其腸、縱肌、呼吸樹各約200 mg，同時抽取體腔液，按照李霞等［12］的方法提取各組織的RNA并反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。根據(jù)已獲得的刺參26S蛋白酶體S7亞基基因全長序列設(shè)計Real－time PCR 引物 S7－F和S7－R，選取 cytb為內(nèi)參基因，其引物序列見表1。

熒光定量 PCR反應(yīng)體系共50 μL，包括2×PCR buffer 25 μL，Primers(25 pmol/μL）2 ×1 μL，Sybr green 0.5 μL，模板 (cDNA）2 μL，DEPC 水20.5 μL。熒光定量PCR擴(kuò)增條件為:94℃下預(yù)變性4 min;94℃下變性20 s，60℃下退火30 s，72℃下延伸30 s，共進(jìn)行35個循環(huán);在72℃下檢測信號。采用FTC2000(Canada公司）實(shí)時熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，每個樣品重復(fù)擴(kuò)增檢測3次。最后將得到的樣品內(nèi)參基因和目的基因的C1值分別代入各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出目的基因mRNA的相對表達(dá)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

各組織的表達(dá)量采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果

2.1 刺參26S蛋白酶體S7亞基基因序列及結(jié)構(gòu)分析

刺參26S蛋白酶體S7亞基基因的cDNA序列全長為2 445 bp，其中5'UTR為70 bp，3'UTR為1 070 bp，開放閱讀框?yàn)? 305 bp，編碼435個氨基酸。保守序列搜索及序列分析表明，該基因的ATP酶組件序列區(qū) (M1）位于第212～395位氨基酸處，其中第217～224位氨基酸 (GPPGTGKT）為ATP的結(jié)合基序，第276～279位氨基酸(DEID）為ATP的水解基序，第320～322位和第333～340位氨基酸分別為RNA/DNA螺旋酶的特征性基序MAT和VRPGRLDR。序列已提交至Genbank中 (GenBank登錄號:JQ922514）。該基因在部分生物的保守區(qū)序列及特征序列比對結(jié)果見圖1，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，各種生物的ATP酶結(jié)合基序與水解基序完全相同，而RNA/DNA螺旋酶的特征性基序有所差異，其中絕大多數(shù)生物均為MAT序列，僅酵母為FAT序列;另一個螺旋酶特征基序在脊椎動物、節(jié)肢動物和線蟲中是MRPGRLDR，在棘皮動物 (海參、海膽）中為VRPGRLDR，在酵母和擬南芥中則分別為LRPGRIDR和LRSGRLDR。

S7亞基的分子式為C2134H3445N601O648S19，原子總數(shù)為6 847，相對分子量為48 498.6，等電點(diǎn)為6.02，正電荷殘基 (Arg+Lys）總數(shù)為64，負(fù)電荷殘基 (Asp+Glu）總數(shù)為68，不穩(wěn)定系數(shù)為35.11，通過計算，該蛋白屬于穩(wěn)定蛋白，脂肪系數(shù)為85.85，親水評估為－0.419，可見該蛋白為親水蛋白。亞基亞細(xì)胞定位的預(yù)測結(jié)果顯示，S7亞基沒有信號肽，也沒有跨膜結(jié)構(gòu)域，為非跨膜蛋白，定位于細(xì)胞中的液態(tài)基質(zhì)中。采用PROF法預(yù)測S7亞基的二級結(jié)構(gòu)，有44.24%的α螺旋，10.14%的β折疊，45.62%的α螺旋和β折疊復(fù)合體。S7亞基的三級結(jié)構(gòu)如圖2所示。

2.2 同源性比較及生物進(jìn)化

將刺參26S蛋白酶體S7亞基氨基酸序列使用在線Blastx軟件進(jìn)行同源性比較，得到結(jié)果見表2。該基因序列與紫海膽Strongylocentrotus purpuratus同源性最高，達(dá)到95%，與高等哺乳動物、鳥類、魚類、兩棲類和節(jié)肢動物等模式動物之間的同源性為88%～89%，與酵母和擬南芥的同源性較低，分別為73%和77%。設(shè)置Bootstrap置信值為1 000，應(yīng)用Mega 5.0軟件構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖3，其中刺參和紫海膽的親緣關(guān)系最近，獨(dú)立聚為一支，脊椎動物和節(jié)肢動物各獨(dú)立聚為一支，線蟲、擬南芥和酵母則單獨(dú)聚為一支。

表2 不同物種氨基酸序列的同源性比對結(jié)果Tab.2 The amino acid sequence identities of different species

圖1 不同生物來源的S7亞基ATP酶組件的氨基酸序列比較Fig.1 Amino acid sequence alignment of subunit 7 ATPase from various organisms

圖2 S7亞基的三級結(jié)構(gòu)Fig.2 The three－dimensional constitution of S7 subunit predicted by Swiss－mode

2.3 26S蛋白酶體S7亞基基因在刺參不同組織中的表達(dá)

熒光實(shí)時定量PCR檢測結(jié)果表明，S7亞基基因在刺參體壁、腸、呼吸樹、縱肌和體腔細(xì)胞中都有表達(dá) (圖4）。經(jīng)單因素方差分析表明，各組織中S7亞基基因的表達(dá)量依次為體腔細(xì)胞＞縱肌帶＞腸＞體壁＞呼吸樹 (P＜0.05）?？梢?，該蛋白酶體的調(diào)節(jié)顆粒中ATP酶活性亞基S7在刺參體腔液中表達(dá)量最高 (P＜0.05），而在體壁和呼吸樹中該基因的表達(dá)量最低 (P＜0.05）。

圖3 刺參S7亞基與其同源體的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 The phylogenetic tree between S7 subunit unit in sea cucumber Apostichopus japonicus and their homologies from other species

圖4 刺參各組織中S7亞基基因的mRNA相對表達(dá)量Fig.4 Relative quantity of S7 subunit gene expressions in the different tissues of sea cucumber Apostichopus japonicus

3 討論

本研究中，首次在刺參中發(fā)現(xiàn)了26S蛋白酶體S7亞基基因的部分序列，并對該基因進(jìn)行了全長克隆，發(fā)現(xiàn)刺參S7亞基基因編碼的氨基酸序列與其他物種的S7亞基基因有著高度的同源性 (73%以上）。這些生物都具有相似的ATP酶亞基保守序列和功能位點(diǎn)，且ATP酶組件中都具有ATP結(jié)合基序和水解基序 (氨基酸序列分別為GPPGTGKT和DEID）兩個特征結(jié)構(gòu)域，也同時存在RNA/DNA螺旋酶的特征性基序MAT和VRPGRLDR。而且，這些生物GPPGTGKT和DEID之間的氨基酸殘基均為51個，DEID與MAT之間相隔的氨基酸殘基均為40個，而MAT與VRPGRLDR之間間隔的氨基酸殘基數(shù)目均為10個。這些極其類似的結(jié)構(gòu)特征說明這4個保守序列在S7亞基發(fā)揮生物學(xué)功能上起著關(guān)鍵作用，同時也說明26S蛋白酶體S7亞基在結(jié)構(gòu)和功能上保守性較高。真核細(xì)胞中，蛋白質(zhì)降解的途徑一般有兩條:一條是通過溶酶體進(jìn)行非特異性降解，主要涉及的蛋白包括膜蛋白和通過胞吞作用獲取的外源蛋白;另一條是通過26S蛋白酶體實(shí)現(xiàn)，胞內(nèi)的絕大多數(shù)蛋白 (80%～90%）都是通過這條途徑進(jìn)行降解［13］。當(dāng)然，只有被多聚泛肽鏈標(biāo)記的蛋白才會被26S蛋白酶體降解，這一系統(tǒng)被稱為泛素－蛋白酶體系統(tǒng)［14］。泛素－蛋白酶體通路是真核細(xì)胞中新蛋白合成的主要數(shù)量控制通路［15］。通過調(diào)節(jié)蛋白的特異性降解，這個通路參與了細(xì)胞增殖和生理功能的調(diào)控。例如:細(xì)胞周期的運(yùn)行必須在細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶 (Cyclin－dependent kinase，CDK）抑制因子及時降解的前提下才能進(jìn)行［16］。鑒于S7亞基的保守性，作者認(rèn)為，刺參的蛋白質(zhì)降解途徑可能也涉及26S蛋白酶體，但由于本研究只在刺參中發(fā)現(xiàn)了26S蛋白酶體的一個亞基，至于其他亞基結(jié)構(gòu)以及26S蛋白酶體是否與泛素作用乃至作用方式等還有待于深入系統(tǒng)地研究。

有報道指出，S7亞基常常與S4和S2亞基結(jié)合在一起形成三聚體，在大麥中發(fā)現(xiàn)這兩個基因的突變會影響有絲分裂，而在果蠅中發(fā)現(xiàn)這兩個亞基與細(xì)胞增殖和變態(tài)相關(guān)［17－18］;S7亞基同源基因在菠菜發(fā)芽期和子葉衰老時表達(dá)量增加，分析認(rèn)為，子葉衰老時該亞基的高表達(dá)導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解活動增加，使降解后所得的氨基酸重復(fù)利用［19］;在患惡性腫瘤病的小鼠中，S7亞基的同源亞基 (MSS1）表達(dá)量較其他調(diào)節(jié)亞基高，因而被認(rèn)為促進(jìn)了肌肉蛋白質(zhì)的水解［20］。也有研究表明，MSS1亞基在患癌小鼠體內(nèi)的表達(dá)量增加與20S亞基并無關(guān)聯(lián)，并不會導(dǎo)致蛋白酶體的組裝及蛋白質(zhì)水解的增加，觀察發(fā)現(xiàn)，MSS1亞基的mRNA主要分布在多聚核糖體上，表明這個亞基參與了翻譯的激活［21］。目前，對水產(chǎn)動物中26S蛋白酶體的功能研究不多，主要集中在基因表達(dá)水平的研究上，如Place等［22］研究發(fā)現(xiàn)，溫度會影響北美西海岸四個地區(qū)的貽貝Mytilus californianus蛋白酶體不同亞基的表達(dá)模式。對瓷蟹Petrolisthes cinctipes和鰕虎魚Gillichthys mirabilis的研究發(fā)現(xiàn)，在接近生物高溫極限時泛素－蛋白酶體通路中的相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)［23－24］。長期提高溫度會使鳉Austrofundulus limnaeus具有一定的環(huán)境適應(yīng)性，從而蛋白酶體調(diào)節(jié)亞基表達(dá)反應(yīng)較?。?5］?？梢妼υ摶虻谋磉_(dá)研究可以輔助揭示生物生理適應(yīng)方面的機(jī)制。

刺參作為一種棘皮動物，其體腔細(xì)胞功能類似于高等動物的血細(xì)胞，涉及營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸、生理功能的調(diào)節(jié)、再生和免疫防御等多種生理功能。近年來，關(guān)于刺參體腔細(xì)胞的種類、吞噬和細(xì)胞免疫功能的研究報道較多［26］，而本研究中發(fā)現(xiàn)，S7亞基在刺參體腔細(xì)胞中表達(dá)量最高，表明該亞基可能與體腔細(xì)胞各項(xiàng)生理活動所需要的轉(zhuǎn)錄翻譯以及蛋白質(zhì)水解有關(guān)。另外，S7亞基在刺參縱肌帶、腸、體壁和呼吸樹中均有表達(dá)。秦艷杰等［27］采用差減文庫的方法發(fā)現(xiàn)，S7亞基以及Cdc2同源基因在刺參再生體壁中高表達(dá)量，由此推測，該亞基在刺參再生過程中的細(xì)胞增殖調(diào)控中發(fā)揮重要的作用，這可能與刺參較強(qiáng)的再生能力相關(guān)。

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Molecular cloning and tissue expression analysis of S7 subunit gene of 26S proteasome in sea cucumber Apostichopus japonicus

ZHAO Xiang－ji1，3，QIN Yan－jie1，2，LI Xia1，LIU Yang1，DING Jian－feng1
(1.Key Laboratory of Marine Bio－resources Restoration and Habitat Reparation in Liaoning Province，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China;2.Key Laboratory of Mariculture＆ Stock Enhancement in North China's Sea，Ministry of Agriculture，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China;3.Poyang Senior Middle School，Shangrao 333100，China）

In this study，S7 subunit gene in 26S proteasome was cloned from coelomocytes in sea cucumberApostichopus japonicususing RACE method for the first time.It was found that the cDNA of the gene had a full length of 2 445 bases in all，including 70 bp of the 5'UTR，1 070 bp of 3'UTR，and open reading frame of 1 305 bp encoding 435 amino acids.The S7 subunit was shown to have typical sequences of ATP －binding motif GPPGTGKT，ATP hydrolytic region DEID and RNA/DNA helicase region MAT and VRPGRLDR，sharing 95%amino acid identity with those in sea urchin，88%－89%with vertebrate，arthropodand and nematode，73%－85%with yeast andArabidopsis thaliana.There was not any signal peptides and trans－membrane domain in the protein coded by S7 gene.The real－time PCR quantification revealed that the expression of S7 subunit gene was observed in 5 tissues of sea cucumber，the maximal level in the coelomocytes，followed by longitudinal muscle and intestine，and the minimum in body wall and respiratory tree.The findings provide the molecular bases for understanding of the function of 26S proteasome in physiological regulation，regeneration and immune mechanisms in sea cucumber.

Apostichopus japonicus;S7 subunit of 26S proteasome;molecular clone;tissue expression

S917.4

A

2095－1388(2013）06－0528－07

2013－03－28

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (30371099）;遼寧省教育廳實(shí)驗(yàn)室專項(xiàng) (2008S064）

趙祥吉 (1986－），男，碩士研究生。E－mail:30965469@qq.com

秦艷杰 (1977－），女，副教授，博士。E－mail:qinyanjie@dlou.edu.cn