組織工程血管化策略的研究進(jìn)展

王宇翀 綜述 薛春雨 審校

組織工程的目的是構(gòu)建具有正常生理功能的組織和器官，用于修復(fù)人體的疾病和缺損[1]，目前已經(jīng)取得了一定的突破[2]。體外構(gòu)建的組織工程化產(chǎn)品中，已有皮膚[3]、軟骨和骨[4]應(yīng)用于臨床。但是，體外構(gòu)建的組織工程化組織缺乏與之相適應(yīng)的血液供應(yīng)系統(tǒng)[5]，是目前組織工程面臨的難點(diǎn)。

現(xiàn)在，組織工程血管化主要有兩類策略。第一類是基于內(nèi)皮細(xì)胞等構(gòu)建新的血管，在這個(gè)過程中生長因子也有促進(jìn)新生血管的作用。第二類是基于支架技術(shù)，包括天然生物衍生的支架和人工合成支架。以上兩種策略沒有明顯界限，而是相互重疊。

1 人體內(nèi)的新生血管形成過程

人體內(nèi)新生血管形成基于兩種過程：血管生成（Angiogenesis）與血管形成（Vasculogenesis）。血管生成是原先存在的血管以出芽的方式生成新的毛細(xì)血管。血管形成是內(nèi)皮細(xì)胞重組后形成毛細(xì)血管，并與原有血管網(wǎng)對(duì)接的過程。最初，內(nèi)皮祖細(xì)胞（Endothelial progenitor cells，EPCs）分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞，這些細(xì)胞在無血管的區(qū)域增殖并且創(chuàng)造了第一個(gè)初始的血管網(wǎng)絡(luò)[6]。然后，新的毛細(xì)血管從原先存在的血管生出，內(nèi)皮細(xì)胞釋放基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs）降解細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞遷移到新的間隙，出芽形成新的血管。這個(gè)過程由多種類型的細(xì)胞、黏附蛋白、生長因子、連接分子、內(nèi)源性抑制劑等共同參與和相互作用而產(chǎn)生[7]。

形成所需生理功能的血管不僅需要時(shí)間順序上的精確調(diào)節(jié)，也需要在血管成熟后抑制內(nèi)皮細(xì)胞的過度生長，從而抑制過多的營養(yǎng)和氧氣供應(yīng)到組織。相反，血管延遲成熟會(huì)抑制血液循環(huán)或?qū)е卵芡嘶踔猎斐裳艽┛?、缺失[8]。

對(duì)于缺血組織再灌注或誘導(dǎo)組織工程血管產(chǎn)生，上述過程是必不可少的。事實(shí)證明，缺血組織新血管生成恢復(fù)再灌注已經(jīng)實(shí)現(xiàn)，然而組織工程產(chǎn)物血管化問題尚未解決。

2 組織工程誘導(dǎo)血管生成的策略

2.1 基于內(nèi)皮細(xì)胞等構(gòu)建血管

機(jī)體內(nèi)所有的血管內(nèi)壁都是由內(nèi)皮細(xì)胞組成的，大的血管外層有平滑肌細(xì)胞包裹，而毛細(xì)血管主要是由血管內(nèi)皮細(xì)胞組成。血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用主要有抗凝、選擇透過性、調(diào)劑血壓和血管生成的作用[9]。

支架上的細(xì)胞得以成活，需要通過擴(kuò)散或灌注得到足夠的營養(yǎng)和氧氣。然而，毛細(xì)管擴(kuò)散的最大距離在100～200 μm[10]。研究表明，只有皮膚、軟骨和骨組織可以接受更遠(yuǎn)的血管通過擴(kuò)散所提供的氧氣和營養(yǎng)，所以目前只有組織工程皮膚、軟骨和骨應(yīng)用于臨床。因此，體外較厚組織的血管化構(gòu)建和體內(nèi)血管的連接，是組織工程化組織構(gòu)建成功的必要條件之一。

在體外，通常把內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等單獨(dú)或混合接種于支架，以構(gòu)建三維血管化的結(jié)構(gòu)。隨后將構(gòu)建的血管網(wǎng)絡(luò)植入缺血區(qū)，建立一個(gè)由周圍血管提供血液的組織，這一過程稱為吻合[11]。體外預(yù)血管化的優(yōu)點(diǎn)是宿主血管不需要長入工程化組織中間，而可以吻合邊緣的血管結(jié)構(gòu)。缺點(diǎn)是灌注慢于體內(nèi)的血管化。許多研究已證明，宿主細(xì)胞能夠在適當(dāng)?shù)娜斯そY(jié)構(gòu)中建立一個(gè)可灌注的血管網(wǎng)絡(luò)[12]，經(jīng)過成功的血管化后，可以取出并用于插入缺血性靶位點(diǎn)。這一方法的缺點(diǎn)是需要至少三次手術(shù)：植入無細(xì)胞支架、取出血管化支架和植入缺血區(qū)[13]。

2.2 生長因子及細(xì)胞因子促進(jìn)血管化

生長因子及細(xì)胞因子對(duì)血管化過程具有重要的促進(jìn)作用，可有效刺激內(nèi)皮細(xì)胞和祖細(xì)胞的聚集與增殖，促進(jìn)新生血管形成及發(fā)育成熟。目前已知的促進(jìn)血管生成的因子主要有 VEGF、bFGF、HGF 等；另外一些細(xì)胞因子，如 PDGF、TGF-β、Ang等，作為間接的血管生成因素參與內(nèi)皮細(xì)胞的再生，加速血管化的進(jìn)程。

為使生長因子效能最大化，往往需先解決一些問題。例如，血管生成因子在體內(nèi)具有高度不穩(wěn)定性，因此多采用局部注射和控釋等手段[14]。為了克服生長因子的高降解率，找到可隨時(shí)間變化釋放生長因子至目標(biāo)植入部位的生物材料，確保生長因子的有效傳遞和持續(xù)發(fā)揮作用，目前合成了各種復(fù)合材料的緩釋裝置[15]。可降解多孔層結(jié)構(gòu)或預(yù)包埋的微球生物材料已用于控制生長因子的釋放，把生長因子包埋在生物可降解的聚合物中，如聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）或多聚賴氨酸（PLL）[16]，這樣生長因子可以持續(xù)釋放。離子白蛋白微球技術(shù)則可以同時(shí)控制兩種生長因子釋放。

另一種方法是使用轉(zhuǎn)染的細(xì)胞過度表達(dá)生長因子。一旦種子細(xì)胞種植在支架上，這些細(xì)胞就可以持續(xù)釋放生長因子。Geiger等[17]將涂有VEGF質(zhì)粒DNA的BMSCs支架和接種轉(zhuǎn)染VEGF質(zhì)粒DNA的BMSCs支架進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組的血管生成和骨生成都顯著增強(qiáng)，其中后者的血管再生更快，骨支架吸收的速度也更快。同樣，心肌梗死后使用VEGF基因轉(zhuǎn)染MSCs可促進(jìn)心肌血管的生成，改善心肌的灌注。

生長因子的劑量和組合方式也是血管生成與否的關(guān)鍵因素。例如，高水平的PDGF會(huì)導(dǎo)致血管的不穩(wěn)定[18]；通過Ang-1過度表達(dá)，來加強(qiáng)三維多孔藻酸鹽支架的血管化，可能會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)皮增生和血管丟失減少[19]。目前，大部分實(shí)驗(yàn)的重點(diǎn)仍然是研究一種類型的生長因子，而生長因子之間和多信號(hào)通路之間復(fù)雜的相互作用也應(yīng)考慮。在新構(gòu)建的水凝膠基質(zhì)上，通過結(jié)合VEGF和Ang-1，或結(jié)合VEGF、IGF、SDF-1的組合，均取得良好效果[20]。

為了避免生長因子在靶點(diǎn)以外的部位產(chǎn)生不良影響，許多研究也致力于生長因子作用部位的固定[21]。Saik等[22]通過共價(jià)固定PDGF-BB在聚乙二醇水凝膠中來促進(jìn)血管生成。除此之外，特定的黏附肽或細(xì)胞外基質(zhì)分子修飾生物材料也可用來促進(jìn)血管生成。

2.3 血管化支架

組織工程中血管化和支架材料的特性有很大的關(guān)系。除了在儲(chǔ)存和釋放功能性化合物和為所有參與其中的細(xì)胞提供合適的表面類型外，支架本身就能夠促進(jìn)血管的形成。人工構(gòu)建細(xì)胞外基質(zhì)的三維支架結(jié)構(gòu)，不但為內(nèi)皮細(xì)胞等的生長提供了一個(gè)有利的空間，也為植入的細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)并最終形成相應(yīng)的組織或器官提供了一個(gè)良好的環(huán)境。血管化支架可分為天然生物衍生的血管支架和人工合成的血管支架兩大類。

2.3.1 天然生物衍生的血管支架

目前在體外模仿天然血管結(jié)構(gòu)和重建微血管網(wǎng)絡(luò)仍具有很大的挑戰(zhàn)性，生物結(jié)構(gòu)的重新利用可能是解決該問題的方法[23]。通過部分脫細(xì)胞基質(zhì)可以得到一個(gè)自然衍生的三維微血管網(wǎng)絡(luò)，脫細(xì)胞基質(zhì)的制作過程揭示了動(dòng)脈和靜脈穿過膠原蛋白和彈性蛋白纖維基質(zhì)的特點(diǎn)[24]。血管化的生物基質(zhì)用于組織工程可提供適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)，確保了更好的移植效果[25]。天然生物衍生的血管支架的優(yōu)點(diǎn)是：①材料的生物相容性較好；②可降解性好，且降解產(chǎn)物無毒副作用；③材料本身具有相同或類似的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，可促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖和分化。其缺點(diǎn)是：①制作過程難以規(guī)范化；②無法復(fù)制出完全相同的支架；③取材在倫理上仍有爭議。

2.3.2 人工合成的血管支架

人工合成的血管支架從簡單的支撐作用，到目前已擴(kuò)展為可以提供機(jī)械穩(wěn)定性、愈合能力與降解率相適應(yīng)的綜合性支架[26]。對(duì)于支架材料的選擇要考慮到支架硬度、表面形態(tài)、結(jié)構(gòu)特性、生物相容性、孔隙率（包括孔徑和孔間距離）和降解特性等[27]。此外，巧妙的三維設(shè)計(jì)和高分辨率制造技術(shù)也可用來精確控制細(xì)胞排列和血管生成[28]。但是，目前尚未發(fā)現(xiàn)一種能同時(shí)滿足上述條件的人工支架。人工合成的血管支架的優(yōu)點(diǎn)是：①可選擇多樣的材料與先進(jìn)的制造技術(shù)；②可以大批量標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)；③根據(jù)實(shí)際需要可進(jìn)行多樣化設(shè)計(jì)。其缺點(diǎn)是：①空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜的幾何形狀制作難度大；②缺乏必要的生物功能；③細(xì)胞黏附力差。

3 存在的問題與展望

組織工程顯示出誘人的前景和巨大的可能，而組織工程血管化仍然是組織工程中的關(guān)鍵問題。既往的研究發(fā)現(xiàn)了許多促進(jìn)血管化的方法，有了一些新的見解和進(jìn)展，但同樣存在許多亟待解決的問題，比如進(jìn)一步闡釋血管化的具體機(jī)制、合理高效利用生長因子、發(fā)現(xiàn)新的支架材料，以及各種因子與材料潛在的風(fēng)險(xiǎn)等。應(yīng)將不同的方法、技術(shù)和學(xué)科結(jié)合在一起，研究更加高效簡便的組織工程血管化方法，為構(gòu)建組織工程化組織并應(yīng)用于臨床奠定基礎(chǔ)。

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