雌激素對模擬失重及飛船艙內(nèi)噪聲下豚鼠內(nèi)耳Caspase-3表達的影響△

韓浩倫 吳瑋 余萌 王方園 屈昌北 張建中 王鴻南 李保衛(wèi) 王剛 孟令照 虞學(xué)軍 吳大蔚 牛聰敏 劉鋼

宇航員在太空中處于失重狀態(tài)，并長時間暴露于飛船艙內(nèi)噪聲、輻射、環(huán)境污染等危害因素中[1]，聽力會出現(xiàn)明顯的暫時性閾移甚至永久性閾移[2,3]。失重及飛船艙內(nèi)噪聲可以引起豚鼠、小鼠聽覺功能損傷并引起內(nèi)耳凋亡標(biāo)志物Caspase-3的表達增強[4～6]。雌激素在生殖系統(tǒng)、心血管、免疫系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)及內(nèi)分泌系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用[7～9]，研究表明，雌激素對風(fēng)洞噪聲造成的聽功能損傷具有保護作用，并減少內(nèi)耳凋亡標(biāo)志物的表達[10,11]，但目前尚缺乏雌激素對失重和噪聲復(fù)合因素所致聽損傷的作用及機制的研究。為此，本研究擬通過觀察雌激素對飛船艙內(nèi)噪聲和失重復(fù)合因素所致豚鼠聽功能損傷及內(nèi)耳毛細胞、血管紋、螺旋神經(jīng)節(jié)細胞上凋亡標(biāo)志物Caspase-3表達的影響，探討雌激素對上述復(fù)合因素所致聽損傷及內(nèi)耳細胞凋亡的保護作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 健康白色紅目豚鼠36只 (北京市海淀區(qū)興隆實驗動物養(yǎng)殖場提供)，雌雄不限，體重300～350 g，耳廓反應(yīng)靈敏，鼓膜標(biāo)志清晰，無強噪聲暴露及耳毒性藥物使用史，隨機分為正常對照組(6只)及實驗組(30只)，實驗組又分為A、B、C三組，每組10只，各實驗組再隨機分為2小組，分別于暴露后(5只)、恢復(fù)后3天(5只)取材。A組(失重+噪聲組)同時給予噪聲暴露和模擬失重處理；B組(雌激素治療組)在給予噪聲暴露和模擬失重處理的同時，給予雌激素治療；C組(雌激素預(yù)防組)給予噪聲暴露和模擬失重處理前，給予雌激素預(yù)防。正常對照組不給任何處理。

1.2雌激素給藥方法 苯甲酸雌二醇注射液由天津金耀氨基酸有限公司生產(chǎn)。B組于噪聲暴露及失重處理當(dāng)天開始每日于后肢肌肉注射苯甲酸雌二醇0.08 mg/kg，首劑加倍，共8天；C組于噪聲暴露及失重處理前3天每日給予后肢肌肉注射苯甲酸雌二醇0.08 mg/kg，首劑加倍，共3天。

1.3模擬失重方法 參考大鼠粘尾懸吊法[6]，采用頭低位模擬失重法[5]，豚鼠前肢承受部分重量，頭低位，做標(biāo)記。保持身體縱軸與水平線呈-30°，共懸吊5天。

1.4噪聲暴露方法 將白噪聲信號發(fā)生器(UZ-3型)經(jīng)均衡器(MEQ)、功率放大器(PA-1000)傳到揚聲器(YZ20-7)，揚聲器放置于豚鼠籠前部，噪聲聲級用BK2250手持式分析儀測量，強度為72±2 dB SPL，持續(xù)暴露5天。隨后給予脈沖噪聲暴露3次，脈沖噪聲由BK1027信號發(fā)生器產(chǎn)生，強度為160 dB SPL，脈寬為30 ms，重復(fù)率為1次/分鐘。

1.5ABR測試 實驗前所有動物進行ABR測試，A、B、C三組豚鼠再分別于實驗結(jié)束后當(dāng)天和結(jié)束后3天行ABR測試。豚鼠給予鹽酸氯胺酮(60 mg/kg)和鹽酸賽拉嗪(4 mg/kg)肌肉注射麻醉后，應(yīng)用腦干誘發(fā)電位儀(MEDSEN)在隔聲靜電屏蔽室內(nèi)檢測短聲誘發(fā)ABR反應(yīng)閾值。記錄電極置于前額正中皮下，參考電極置于對側(cè)耳后乳突區(qū)皮下，接地電極置于鼻尖。從高聲強開始，依次以20、10、5 dB SPL逐漸衰減，以能誘發(fā)出可辨認波Ⅲ的最低強度為反應(yīng)閾，在閾值強度重復(fù)檢測1次。測試過程中保持環(huán)境溫度在38 ℃左右。

1.6凋亡標(biāo)志物Caspase-3免疫組織化學(xué)染色 實驗動物應(yīng)用鹽酸氯胺酮(60 mg/kg)和鹽酸賽拉嗪(4 mg/kg)肌肉注射麻醉后，斷頭取出雙側(cè)顳骨，以4%多聚甲醛耳蝸內(nèi)灌流固定24 h。EDTA脫鈣14天，梯度酒精脫水,二甲苯透明，石蠟包埋，常規(guī)沿蝸軸水平切片，行耳蝸切片的動物是隨機選擇的，切片厚度為3 μm。石蠟切片脫蠟和水化，pH6.0的0.01 mol/L的枸櫞酸鹽緩沖液煮沸熱修復(fù)抗原10 min，3% H2O2室溫孵育10 min，小牛血清封閉10 min，加Caspase-3抗體(Enzo，美國)1:100于4 ℃孵育過夜，加二抗(欣博盛生物公司，上海)室溫孵育10 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片；用PBS代替抗體陰性對照。免疫組化染色結(jié)果由2名以上病理醫(yī)師雙盲判別。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 各組豚鼠ABR反應(yīng)閾比較采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行配對t檢驗和SNK方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組豚鼠ABR反應(yīng)閾

2.1.1對照組動物ABR反應(yīng)閾為11.25±3.77 dB SPL，各實驗組動物不同時間ABR反應(yīng)閾見表1?？梢?，實驗前各組ABR反應(yīng)閾比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.103，P=0.339)，暴露后當(dāng)天 B組ABR反應(yīng)閾顯著低于A、C組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而A、C組間反應(yīng)閾差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。恢復(fù)后3天，A、B、C三組間反應(yīng)閾比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各實驗組動物不同時間ABR反應(yīng)閾

注：*與暴露后當(dāng)天A組和C組比較，P<0.05

2.1.2實驗組動物暴露前后、恢復(fù)前后ABR閾移比較 暴露前后， B組閾移低于A、C組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而C組與A組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；恢復(fù)前后，C組閾移大于A、B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，B組與A組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

表2 各實驗組動物暴露前后和恢復(fù)前后ABR閾移比較

注：*與A、C組暴露前后比較，P<0.05；△ 與A、B兩組恢復(fù)前后比較，P<0.05

2.2內(nèi)耳細胞凋亡標(biāo)志物Caspase-3的表達 對照組內(nèi)耳毛細胞、血管紋和螺旋神經(jīng)節(jié)Caspase-3染色均為陰性(圖1)。

A、B和C組暴露后當(dāng)天，毛細胞Caspase-3表達均為陽性，較對照組表達增強，其中C組最強；恢復(fù)3天后，三組動物內(nèi)耳毛細胞Caspase-3表達仍為陽性，較對照組表達增強(圖2)。

A、B和C組暴露后當(dāng)天，血管紋Caspase-3表達為陽性，較對照組增強,其表達由強到弱依次為C、A、B組；恢復(fù)3天后，三組動物血管紋Caspase-3表達仍為陽性，但A、C組較暴露后當(dāng)天稍減弱，B組較暴露后當(dāng)天表達增強(圖3)。

A、B和C組暴露后當(dāng)天，內(nèi)耳螺旋神經(jīng)節(jié)Caspase-3表達均為陽性，較對照組增強；恢復(fù)3天后，三組動物Caspase-3表達仍為陽性，較暴露后當(dāng)天無明顯變化(圖4)。

3 討論

大樣本正常人群調(diào)查發(fā)現(xiàn)，老年男性(70～75歲)比同齡女性高頻聽力降低約10～25 dB[12]，女性在絕經(jīng)期后才出現(xiàn)年齡相關(guān)性聽力下降，而男性相對提前出現(xiàn)[13]。這些差異不能單純解釋為解剖異?；蚵殬I(yè)性噪聲影響，可能與內(nèi)源性雌激素水平降低，失去對聽覺系統(tǒng)的保護作用有關(guān)。有學(xué)者通過藥物試驗進一步證實了雌激素對聽覺系統(tǒng)具有一定的保護作用[14，15]。雌激素的功能主要是通過雌激素受體(estrogen receptors,ERs)來調(diào)節(jié)，雌激素受體主要由ERɑ和ERβ組成。研究表明，隨著年齡變化，雌激素的兩種受體ERɑ和ERβ在不同時間點和中樞聽覺通路的不同位置表達均有不同[16]，表明每一種雌激素受體亞型在不同時期的中樞聽覺通路中扮演不同的角色，其中ERβ可以保護小鼠耳蝸免受噪聲創(chuàng)傷[10,17]。通過對不同階段ERβ基因敲除小鼠和野生型小鼠的研究，可以發(fā)現(xiàn)兩者聽覺功能和內(nèi)耳形態(tài)不同， ERβ 基因敲除小鼠比野生型小鼠較早出現(xiàn)耳聾，ERβ對預(yù)防年齡相關(guān)性聽力損失很重要[18]。Megalin基因作為包括雌激素在內(nèi)的各種脂質(zhì)代謝物內(nèi)吞作用的受體，在耳蝸中主要表達于血管紋的邊緣細胞。Megalin基因缺陷小鼠攝取雌激素降低，接觸噪聲后呈漸進性聽力損失，也說明雌激素可能是通過Megalin基因發(fā)揮作用的[19]。

噪聲性聽力損失與內(nèi)耳毛細胞及螺旋神經(jīng)節(jié)細胞的凋亡有密切關(guān)系。關(guān)于內(nèi)耳細胞凋亡的研究表明，Caspase-3可能是細胞凋亡途徑下游的關(guān)鍵執(zhí)行者[20～22]。近年來有學(xué)者提出Caspase-3不僅通過細胞凋亡介導(dǎo)細胞死亡，在神經(jīng)遞質(zhì)的傳導(dǎo)中還起著“神經(jīng)調(diào)質(zhì)”的作用[23,24]。本研究結(jié)果提示在噪聲和失重暴露的同時使用雌激素治療， 可減少暴露后即刻內(nèi)耳細胞凋亡，而對恢復(fù)過程中的內(nèi)耳毛細胞凋亡無明顯影響；在噪聲和失重暴露前預(yù)防性使用雌激素雖然可導(dǎo)致暴露后即刻內(nèi)耳毛細胞凋亡增加，但可有效減少恢復(fù)過程中的細胞凋亡。

圖1 對照組Caspase-3免疫組織化學(xué)染色 a、b、c依次為毛細胞、血管紋和螺旋神經(jīng)節(jié)(免疫組化染色×40)

圖2 各實驗組Corti器Caspase-3免疫組織化學(xué)染色 a1、b1、c1分別為A、B和C組暴露后當(dāng)天；a2、b2、c2分別為A、B、C組恢復(fù)3天后(免疫組化染色×40)

圖3 各實驗組血管紋Caspase-3免疫組織化學(xué)染色 a1、b1、c1分別為A、B和C組暴露后當(dāng)天；a2、b2、c2分別為A、B、C組恢復(fù)3天后(免疫組化染色×40)

圖4 各實驗組螺旋神經(jīng)節(jié)Caspase-3免疫組織化學(xué)染色 a1、b1、c1分別為A、B和C組暴露后當(dāng)天；a2、b2、c2分別為A、B、C組恢復(fù)3天后(免疫組化染色×40)

本實驗中，從ABR閾值變化看，模擬飛船艙內(nèi)噪聲和失重復(fù)合因素可導(dǎo)致豚鼠聽功能損傷和內(nèi)耳細胞的凋亡，治療性使用雌激素可有效減輕噪聲和失重復(fù)合因素對實驗動物聽功能的損傷，還可促進聽損傷的恢復(fù)；而預(yù)防性使用雌激素對上述復(fù)合因素造成的聽損傷即刻雖無保護作用，但卻能有效促進聽損傷的恢復(fù)。結(jié)合本研究中C組Caspase-3的表達在暴露后即刻強于A組和B組，而其聽損傷并非各組間最強，說明噪聲和失重復(fù)合因素所造成的聽損傷并非單一通過細胞凋亡途徑實現(xiàn)，推測可能有細胞壞死途徑參與。從C組的實驗結(jié)果看，在聽損傷的恢復(fù)過程中，預(yù)防性使用雌激素對內(nèi)耳聽損傷所致的細胞凋亡有一定的保護作用，可能通過ERβ作用于聽功能損傷和細胞凋亡的下游因子，從而減少恢復(fù)過程中細胞凋亡的發(fā)生；推測其可能通過增強Caspase-3的“神經(jīng)調(diào)質(zhì)”作用，從而加快噪聲和失重復(fù)合因素暴露后3天的聽力恢復(fù)過程，但其具體機制尚需進一步探索。

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