TNF－α 和鈣－鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ在大鼠心肌缺血后適應(yīng)中的作用*

劉 敏， 張家明， 李 超， 郝海菊， 李景東

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院心內(nèi)科，湖北 武漢430022)

近年來(lái)在多種動(dòng)物和人類發(fā)現(xiàn)心肌缺血預(yù)適應(yīng)和后適應(yīng)現(xiàn)象，即在心肌缺血前后給予多次短暫的缺血再灌注能減輕隨后的再灌注損傷，兩者具有內(nèi)源性心肌保護(hù)作用，受到實(shí)驗(yàn)和臨床研究的高度重視。由于臨床上心肌梗死的發(fā)生有一定程度的不可預(yù)知性，因而進(jìn)行缺血后適應(yīng)干預(yù)治療更具有應(yīng)用前景［1］，但是其發(fā)生機(jī)制尚未闡明［2－3］。

研究表明，心肌缺血再灌注時(shí)可產(chǎn)生腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF－α)等多種炎性細(xì)胞因子，細(xì)胞鈣超載等也參與細(xì)胞的損傷過(guò)程。鈣－鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(calcium－calmodulin－dependent protein kinase II，CaMKII)是一種分布廣泛的多功能絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，介導(dǎo)的底物磷酸化和去磷酸化是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)，也是胞內(nèi)代謝調(diào)節(jié)的最重要因素之一，通過(guò)磷酸化肌漿網(wǎng)鈣泵和受磷蛋白等在調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣離子平衡過(guò)程中發(fā)揮重要作用［4］，但是目前有關(guān)缺血后適應(yīng)對(duì)TNF－α 和CaMKⅡ的影響報(bào)道甚少［2－3］，本研究通過(guò)建立心肌缺血再灌注損傷模型，觀察缺血后適應(yīng)對(duì)心肌組織TNF－α 和CaMKⅡ水平變化的影響，并應(yīng)用重組人腫瘤壞死因子受體:Fc 融合蛋白(recombinant human tumor necrosis factor receptor:Fc fusion protein，rhTNFR:Fc)以中和缺血再灌注過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)量TNF－α，探討兩者在心肌缺血后適應(yīng)中的作用和機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料和主要試劑

成年SD 雄性大鼠重200 ～250 g，購(gòu)自同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。TNF－α 及CaMKII－PThr287Ⅰ抗購(gòu)自Cell Signaling Technology。CaMKII 及GAPDHⅠ抗購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology。相應(yīng)的Ⅱ抗均購(gòu)自武漢安特捷生物技術(shù)有限公司。ECL 發(fā)光試劑盒購(gòu)自Amersham。Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Green 熒光定量PCR 試劑盒均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。rhTNFR:Fc 購(gòu)自上海中信國(guó)健藥業(yè)有限公司。TNF－α 引物序列上游為5＇－CAAAACTGCAGTGACAAGCC－3＇，下游為5＇－GGACTCCGTGATGTCTAAGT－3＇;β－actin 引物序列上游為5＇－CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC－3＇，下游為5＇－ATGGAGCCACCGATCCACA－3＇，由武漢生命技術(shù)公司合成。伊文思藍(lán)購(gòu)自Sigma。2，3，5－氯化三苯基四氮唑(2，3，5－triphenyl tetrazolium chloride，TTC)購(gòu)自上海索萊寶生物科技有限公司。其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

2 主要方法

2.1 缺血再灌注模型 SD 大鼠用10%水合氯醛以3 mL/kg濃度腹腔注射麻醉。將SD 大鼠固定于手術(shù)臺(tái)，氣管切開(kāi)后接小動(dòng)物呼吸機(jī)(上海奧爾科特生物科技有限公司)，潮氣量按30 mL/kg 設(shè)定。于左側(cè)第3 ～4 肋間開(kāi)胸暴露心臟，破心包膜。接BL－420F 生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，平衡15 min。于左心耳根部下方2 mm 處用6－0 帶線縫合針盲扎左冠狀動(dòng)脈前降支，將縫合線穿過(guò)橡膠管打一活結(jié)。心臟表面顏色呈蒼白、發(fā)紺，同時(shí)心電圖ST 段抬高提示結(jié)扎成功。結(jié)扎30 min后，打開(kāi)活結(jié)，進(jìn)行再灌注2 h。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組 將SD 大鼠分為5 組:假手術(shù)組(sham 組，n=16)，只分離左前降支，不結(jié)扎;缺血再灌注組(IR 組，n =16)，同2.1 方法;缺血后適應(yīng)組(IP 組，n =16)，缺血30 min后，給予10 s 再灌注/10 s 缺血，共循環(huán)3 次，之后給予119 min 再灌注;rhTNFR:Fc+缺血再灌注組(F+IR 組，n=16)及rhTNFR:Fc+缺血后適應(yīng)組(F +IP 組，n =16)，術(shù)前按1.75 mg/kg 腹腔注射rhTNFR:Fc，余步驟分別同缺血再灌注組和缺血后適應(yīng)組。其中每組中的8 只心臟用于Western blotting和RT－PCR 檢測(cè)，其余的8 只用于測(cè)定心肌梗死面積。

2.3 心肌梗死面積測(cè)定 待再灌注2 h 結(jié)束后，永久性結(jié)扎左前降支，從升主動(dòng)脈逆行性注射1 mL 1%伊文思藍(lán)，待整個(gè)心臟變藍(lán)后，迅速將其取出，放入PBS 溶液中清洗干凈，去除心房及右室。將處理后的心臟放入－20 ℃冰箱冷凍15 min 后取出，用刀片橫切成2 mm 薄片，再放入現(xiàn)配pH 7.4 的1%TTC 中孵育20 min，之后放入10%多聚甲醛中過(guò)夜。相機(jī)拍照后，用Image－Pro Plus 6.0 軟件測(cè)定心肌梗死面積、缺血區(qū)面積及總面積。

2.4 Western blotting 檢測(cè) 從－80 ℃冰箱中取出心臟，去除心房和右心室。肌漿網(wǎng)內(nèi)和細(xì)胞內(nèi)蛋白提取方法同文獻(xiàn)所述［5］。按照每孔50 μg 上樣，SDS－PAGE 電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。用5%脫脂牛奶封閉，然后Ⅰ抗4 ℃孵育過(guò)夜。相應(yīng)Ⅱ抗室溫孵育2 h 后，暗室中ECL 發(fā)光劑曝光。蛋白條帶相對(duì)濃度用Quantity One Software 軟件測(cè)定。

2.5 RT－PCR 檢測(cè) 取100 mg 左室前壁組織用Trizol 提取mRNA。用260 nm 吸光度值測(cè)定RNA 濃度。0.5 μg RNA 加入10 μL 混合液中，在37 ℃15 min 和85 ℃5 s 孵育進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程。1 μL cDNA 加入10 μL 混合液中進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR 過(guò)程?；虮磉_(dá)量用StepOne Software2.1 軟件計(jì)算。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 缺血后適應(yīng)及rhTNFR:Fc 對(duì)大鼠心肌梗死面積的影響

與sham 組比較，IR 組梗死面積/缺血區(qū)面積及缺血區(qū)面積/總面積的比值均顯著增加(P ＜0.01);與IR 組比較，IP 組以及F+IR 組和F+IP 組均顯著減少(P ＜0.01)，其中F+IP組的比值減少最明顯，見(jiàn)圖1、2。

Figure 1. The ratio of infarct area to ischemic area in the five groups. ±s. n =8. ＊＊P ＜0.01 vs IR;##P ＜0.01 vs IP;△△P ＜0.01 vs F+IR.圖1 各組心肌梗死面積/缺血面積的比值

Figure 2. The ratio of ischemic area to total area in the five groups. ±s. n =8. ＊＊P ＜0.01 vs IR;##P ＜0.01 vs IP;△△P ＜0.01 vs F+IR.圖2 各組心肌缺血面積/總面積的比值

2 各組心肌組織TNF－α 表達(dá)的變化

與sham 組比較，其余各組TNF－α 蛋白表達(dá)均顯著升高(P ＜0.01);與IR 組比較，IP 組以及F +IR 組和F +IP 組均顯著降低(P ＜0.01)，其中F +IP 組降低最明顯，見(jiàn)圖3。心肌組織TNF－α mRNA 表達(dá)相對(duì)量如圖4 所示，與TNF－α蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果一致。

3 各組心肌組織CaMKⅡ蛋白表達(dá)和活性的變化

心肌組織CaMKⅡ蛋白表達(dá)如圖5 所示，與sham 組比較，IR、IP、F+IR 組及F +IP 組均顯著降低(P ＜0.01)。與sham 組比較，IR 組p－CaMK Ⅱ蛋白表達(dá)顯著降低(P ＜0.01);與IR 組比較，IP 組、F +IR 組和F +IP 組均明顯升高(P ＜0.01)，其中以F+IP 組升高最為顯著，見(jiàn)圖6。

討 論

Figure 3. The relative expression of TNF－α protein in the five groups. ±s. n =8. ＊＊P ＜0.01 vs IR;##P ＜0.01 vs IP;△△P ＜0.01 vs F+IR.圖3 各組TNF－α 蛋白表達(dá)的相對(duì)量

Figure 4. The relative expression of TNF－α mRNA in the five groups. ± s. n =8. ＊＊P ＜0.01 vs IR;##P ＜0.01 vs IP;△△P ＜0.01 vs F+IR.圖4 各組TNF－α mRNA 表達(dá)的相對(duì)量

Figure 5. The protein expression of CaMKⅡ. ±s.n = 8. ＊＊P ＜0.01 vs IR;##P ＜0.01 vs IP;△△P ＜0.01 vs F+IR.圖5 各組CaMKⅡ蛋白的表達(dá)

Figure 6. The protein expression of p－CaMKⅡ. ±s.n=8. ＊＊P ＜0.01 vs IR;##P ＜0.01 vs IP;△△P ＜0.01 vs F +IR.圖6 各組p－CaMKⅡ蛋白的表達(dá)

近年發(fā)現(xiàn)，在多種動(dòng)物和人類存在心肌缺血后適應(yīng)對(duì)心臟的保護(hù)作用，其發(fā)生機(jī)制包括減少氧自由基的產(chǎn)生和細(xì)胞內(nèi)鈣超載、減輕內(nèi)皮功能失調(diào)等被動(dòng)機(jī)制以及主動(dòng)激活再灌注損傷保護(hù)激酶和其它蛋白激酶而產(chǎn)生保護(hù)作用，但尚未完全闡明［2－3］。目前認(rèn)為，缺血再灌注損傷涉及一系列多因素參與的復(fù)雜病理生理過(guò)程，包括細(xì)胞因子參與的炎癥反應(yīng)、氧自由基、細(xì)胞內(nèi)鈣超載等因素引起細(xì)胞、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)甚至基因的損傷。研究表明，急性缺血再灌注可導(dǎo)致心肌自分泌和釋放TNF－α［6］，TNF－α 能誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，后者激活NFkappa B 轉(zhuǎn)位［7］，在炎癥反應(yīng)損傷過(guò)程中發(fā)揮重要作用［8－9］，另一方面，在心肌缺血預(yù)適應(yīng)過(guò)程中對(duì)心肌具有保護(hù)作用［10－11］。TNF－α 對(duì)心肌損傷和保護(hù)的雙重作用，表現(xiàn)為濃度和時(shí)間依賴性并且與TNF－α 作用的受體類型有關(guān)，即TNF－α 在高濃度時(shí)主要與TNFR1 受體結(jié)合加重細(xì)胞損傷，而在低濃度時(shí)主要與TNFR2 受體結(jié)合發(fā)揮保護(hù)作用［9，12］。但是TNF－α 在心肌缺血后適應(yīng)中的作用目前尚不清楚［3，11］，因此本研究通過(guò)建立大鼠缺血再灌注損傷模型，觀察到缺血再灌注組心肌梗死面積、心肌組織TNF－α 含量較對(duì)照組明顯增加，而缺血后適應(yīng)組較缺血再灌注組和對(duì)照組均明顯減少，提示缺血后適應(yīng)的心肌保護(hù)作用可能與缺血后適應(yīng)減少TNF－α 的產(chǎn)生有關(guān)。Kin 等［7］也觀察到，缺血后適應(yīng)能抑制大鼠心肌氧化應(yīng)激反應(yīng)介導(dǎo)的NF－kappa B 轉(zhuǎn)位和TNF－α 釋放從而減輕細(xì)胞凋亡。

為證實(shí)上述推測(cè)，我們應(yīng)用重組人腫瘤壞死因子受體融合蛋白rhTNFR:Fc 以中和缺血再灌注過(guò)程中產(chǎn)生的高濃度TNF－α，結(jié)果顯示，心肌梗死面積在rhTNFR:Fc 并缺血再灌注組較缺血再灌注組明顯減少，提示通過(guò)應(yīng)用rhTNFR:Fc 降低TNF－α 含量可減少心肌梗死面積，支持缺血后適應(yīng)可能同樣通過(guò)減少TNF－α 的產(chǎn)生而發(fā)揮心肌保護(hù)作用的推斷。其機(jī)制可能通過(guò)降低缺血再灌注時(shí)高濃度的TNF－α 到較低水平，一方面減少與TNFR1 受體的結(jié)合從而減輕損傷反應(yīng)，另一方面通過(guò)與TNFR2 受體結(jié)合發(fā)揮保護(hù)作用，這有待進(jìn)一步證實(shí)。本研究還觀察到，心肌梗死面積在rhTNFR:Fc 并缺血后適應(yīng)組較rhTNFR:Fc 并缺血再灌注組以及缺血后適應(yīng)組均有進(jìn)一步減少，提示聯(lián)合應(yīng)用rhTNFR:Fc 和缺血后適應(yīng)能增強(qiáng)缺血后適應(yīng)的心肌保護(hù)作用，并且效果優(yōu)于二者單用。

細(xì)胞內(nèi)鈣超載是缺血再灌注損傷的病理生理機(jī)制之一［8］，肌漿網(wǎng)在調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣離子濃度方面發(fā)揮重要作用，在心肌缺血再灌注時(shí)肌漿網(wǎng)功能失調(diào)，肌漿網(wǎng)CaMKⅡ活性降低［13］。CaMKⅡ的活性主要受Ca2+和鈣調(diào)蛋白調(diào)節(jié)，激活的CaMKⅡ通過(guò)多種途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+平衡。已有研究表明CaMKⅡ的激活可以磷酸化肌漿網(wǎng)中多種蛋白質(zhì)，包括肌漿網(wǎng)鈣泵、受磷蛋白和蘭尼堿受體等，通過(guò)磷酸化這些蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)肌漿網(wǎng)鈣離子平衡，但目前尚不清楚缺血后適應(yīng)是否對(duì)心肌胞內(nèi)CaMKⅡ含量和活性存在影響［3，14］。本研究觀察到心肌缺血再灌注組肌漿網(wǎng)CaMKⅡ含量和活性較假手術(shù)組均降低，這與先前的報(bào)道一致［9］;缺血后適應(yīng)組、rhTNFR:Fc 并缺血再灌注組及rhTNFR:Fc 并缺血后適應(yīng)組CaMKⅡ含量也較假手術(shù)組均降低，提示缺血后適應(yīng)以及應(yīng)用rhTNFR:Fc 不能完全消除缺血再灌注降低CaMKⅡ含量的作用。但是缺血后適應(yīng)能減輕缺血再灌注時(shí)CaMKⅡ活性降低的程度，從而維持CaMKⅡ活性接近正常水平，有利于肌漿網(wǎng)多種蛋白質(zhì)的磷酸化，發(fā)揮肌漿網(wǎng)對(duì)鈣離子攝取和釋放的功能，以維持胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，減輕缺血再灌注時(shí)鈣超載的發(fā)生，這與Osada等［15］有關(guān)缺血預(yù)適應(yīng)能維持缺血再灌注時(shí)肌漿網(wǎng)CaMKⅡ活性的報(bào)道一致，表明肌漿網(wǎng)CaMKⅡ在心肌缺血后適應(yīng)的過(guò)程中起重要作用。

重組人腫瘤壞死因子受體融合蛋白可以特異性地與TNF－α 結(jié)合，從而阻斷TNF－α 與其受體的相互作用，目前已有效用于治療多種炎癥性疾病［16］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，低劑量TNF－α 對(duì)組織細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用，而大劑量TNF－α 引起組織細(xì)胞損害，最近有報(bào)道不同劑量TNF－α 對(duì)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞Nrf2 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性產(chǎn)生不同影響［17］。本研究結(jié)果顯示，心肌缺血后適應(yīng)時(shí)，TNF－α 含量降低，CaMKⅡ活性明顯增強(qiáng)，在應(yīng)用rhTNFR:Fc 中和TNF－α 后，CaMKⅡ活性進(jìn)一步增強(qiáng)，其機(jī)制可能是心肌缺血區(qū)TNF－α 降低到適度水平主要與TNFR2 受體結(jié)合［6，9］，引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子輕度增加［18］，能有效激活多種鈣離子依賴蛋白酶，包括CaMKⅡ、ERK、MSKI、cPLA2、PKC 等。

本研究尚存在一定局限性，包括未直接觀察心肌組織不同的TNF－α 水平對(duì)TNFR1 受體和TNFR2 受體功能以及CaMKⅡ含量和活性的影響，如能敲除或者沉默CaMKⅡ基因和TNFR2 基因、在后適應(yīng)前給予CaMKⅡ抑制劑則更能說(shuō)明CaMKⅡ的作用，這些有待繼續(xù)研究。

(致謝:在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，劉學(xué)剛碩士、楊勇博士提供了技術(shù)方面的幫助并提出了建設(shè)性意見(jiàn)，在此表示感謝。)

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