鹽霉素抑制耐格列衛(wèi)的人慢性粒細胞白血病細胞株K562/Glv 增殖并誘導其凋亡*

徐霜清， 祝愛珍， 劉成成， 許婷婷， 陳小宇， 劉革修△

(1 中南大學湘雅醫(yī)學院檢驗系，湖南 長沙410013;2 廣州金域醫(yī)學檢驗中心，廣東 廣州510330;3暨南大學醫(yī)學院血液病研究所，廣東 廣州510632)

盡管酪氨酸激酶抑制劑伊馬替尼可抑制BCRABL 激酶活性，對慢性期慢性粒細胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)治療有效，但很難達分子學緩解。越來越多的研究表明，白血病復發(fā)和耐藥的根本原因是白血病干細胞(leukemia stem cells，LSC)的存在［1］。因此，尋找新的、清除LSC 的藥物以減少耐藥與復發(fā)十分必要。最近的研究發(fā)現(xiàn)一種名為鹽霉素(salinomycin)的抗生素可以直接殺死腫瘤干細胞，其殺死小鼠身上乳腺癌干細胞的效力比普通抗癌藥物泰克索(taxol)高100 倍［2－3］。本實驗觀察鹽霉素對耐格列衛(wèi)的白血病細胞株K562/Glv 細胞增殖的影響，并對其作用機制進行了初步研究，為鹽霉素應用于慢性粒細胞白血病治療探索新的思路。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

鹽霉素、臺盼藍、Triton X－100、DMSO 和PI 染料購自Sigma。RPMI－1640 培養(yǎng)液和胎牛血清購自Gibco。細胞內活性氧(reactive oxygen species，ROS)、caspase－3、caspase－8、caspase－9 和JC－1線粒體膜電位(ΔΨm)檢測試劑盒購自碧云天生物技術有限公司。細胞色素C 凋亡檢測試劑盒購自Bio-Vision。Fluo－3AM 購自Biotium。Epics XL 型流式細胞儀購自Beckman Coulter。Annexin V－PI 雙染測定細胞凋亡試劑盒購自Invitrogen。

2 細胞和細胞培養(yǎng)

格列衛(wèi)耐藥慢粒細胞株K562/Glv 由天津中國醫(yī)學科學院血液病研究所惠贈。細胞用含10% 胎牛血清、1 ×105U/L 青霉素及100 mg/L 鏈霉素的RPMI－1640 培養(yǎng)液，置于含5% CO2、飽和濕度、37 ℃孵箱中培養(yǎng)，2 ～3 d 傳代。

3 鹽霉素對細胞生長的抑制作用

檢測鹽霉素對K562/Glv 細胞的劑量－效應關系，取對數(shù)生長期細胞，調整密度為2 ×108cells/L，100 μL/well，鹽霉素設有0.1、0.2、0.4、0.8 和1.6 μmol/L 濃度梯度，設5 個復孔，同時設DMSO 對照孔和不加細胞的調零孔，5%CO2、飽和濕度、37 ℃孵育48 h，加入CCK－8 試劑孵育3 h 后在全自動酶標儀上檢測各孔的吸光度(A)值(測量波長490nm)。根據(jù)實驗數(shù)據(jù)計算得半數(shù)抑制濃度(half inhibitory concentration，IC50)=0.37 μmol/L。繪制0.2 μmol/L 鹽霉素對K562/Glv 細胞的時間－效應曲線，孵育時間:0、24、48、72、96 h，測量方法同上。

4 Annexin V－PI 雙染測定細胞凋亡

取對數(shù)生長的K562/Glv 細胞，2 ×105cells/well接種至12 孔板內，以0.2 μmol/L 鹽霉素處理，對照組加入1% DMSO，作用48 h 后，消化收集細胞，PBS洗滌，棄上清，加入200 μL 試劑盒提供的結合緩沖液，重懸細胞后，分別加入10 μL Annexin V－FITC和5 μL PI，輕輕混勻，4 ℃避光反應30 min，再加入300 μL 結合緩沖液，上機檢測。

5 ΔΨm、ROS 和細胞內Ca2+濃度(［Ca2+］i)的檢測

取對數(shù)生長期的K562/Glv 細胞，以2 ×105cells/well 接種至12 孔板，加入0.2 μmol/L 鹽霉素處理，在6 h、12 h、24 h 時收集細胞，PBS 洗滌2 遍。500 μL JC－1(10 mg/L)重懸細胞檢測ΔΨm，500 μL DCFH－DA (5 μmol/L)重懸細胞檢測細胞產生的ROS，10 μmol/L 熒光染料Fluo－3AM 檢測［Ca2+］i濃度，37 ℃避光孵育20 min，PBS 洗3 次，即刻用流式細胞儀檢測，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為530 nm。

6 檢測caspase－3、caspase－8 和caspase－9 活性

取對數(shù)生長期的K562/Glv 細胞，以2 ×105cells/well 的密度接種至12 孔板，加入鹽霉素0.2 μmol/L，分別處理0、12、24 h，按照試劑盒說明收集細胞，預冷PBS 洗滌后重懸于細胞裂解液中，冰上裂解30 min，4 ℃下10 000 ×g 離心10 min，取上清加入顯色底物(caspase－3 底物Ac－DEVD－pNA、caspase－8底物Ac－IETD－pNA 和caspase－9 底物Ac－LEHD－pNA)，終濃度50 μL/L，均勻混合并加入到96 孔板中，每組5 個復孔，避光孵育4 h，在405 nm 處檢測A 值。

7 Western blotting 檢測細胞色素C、Bcl－2、Bax、β－catenin 和磷酸化低密度脂蛋白受體相關蛋白6(phosphorylated low－density lipoprotein receptor－related protein 6，p－LRP6)的表達

取對數(shù)生長期的K562/Glv 細胞，分別以0.2、0.4、0.8、1.6 μmol/L 鹽霉素處理48 h，收集細胞PBS 洗2 遍，加入蛋白抽提液抽提總蛋白。取蛋白50 μg，經10% SDS－PAGE 電泳分離，常規(guī)轉移至PVDF 膜，5% 脫脂奶粉37 ℃封閉2 h，鼠抗人細胞色素C、Bcl－2、Bax、β－catenin 抗體(Santa Cruz)、p－LRP6(Ser1490)抗體(Cell Signaling Technology)或β－actin 抗體(Chemicon International)4 ℃孵育過夜，1∶5 000 稀釋的HRP 標記的Ⅱ抗室溫孵育1 h，化學發(fā)光法觀察蛋白的表達。目的條帶用Image－Pro Plus 分析軟件進行灰度值分析，以β－actin 內參照校正。

8 統(tǒng)計學處理

結 果

1 鹽霉素對K562/Glv 細胞增殖的抑制作用和誘導凋亡作用

結果顯示，0.1 ～1.6 μmol/L 鹽霉素對K562/Glv 細胞生長呈劑量依賴性抑制作用，0.1、0.2、0.4、0.8 和1.6 μmol/L 鹽霉素細胞增殖抑制率分別為(89.56 ± 2.30)%、(28.70 ± 2.31)%、(53.77 ±3.02)%、(75.98 ±3.30)%和(89.56 ±3.43)%，與對照組比較差異顯著(P ＜0.05)，見圖1A。計算得IC50=0.37 μmol/L。0.2 μmol/L 鹽霉素處理K562/Glv 細胞24 h 時即顯示明顯細胞增殖抑制作用，抑制率為(14.78 ±2.24)%，隨著時間延長抑制作用越來越明顯，72 h 細胞抑制率為(43.86 ±2.31)%，96h為(55.34 ±3.42)%，見圖1B。流式細胞術檢測結果顯示0.2 μmol/L 鹽霉素能夠誘導K562/Glv 細胞凋亡，出現(xiàn)明顯亞G1二倍體峰，且隨著時間的增加，作用越明顯，48 h 細胞凋亡率為(15.66 ±2.23)%，對照組及DMSO 組凋亡率分別為(5.63 ±1.47)%和(5.70 ±1.48)%，見圖2。

2 鹽霉素對K562/Glv 細胞ΔΨm、ROS 和［Ca2+］i的影響

結果顯示，0.2 μmol/L 鹽霉素作用K562/Glv細胞，ΔΨm在6 h 時即顯著下降，24 h 時下降至最低，為對照組的(47.5 ±2.3)%;細胞內ROS 在6 h時已顯著升高，24 h 時仍然高于對照組水平(144.7±4.5)%;［Ca2+］i在6 h 時已顯著升高，為對照組的(163.6 ± 5.6)%，24 h 時下降至接近對照組水平。

Figure 1. Inhibitory effect of salinomycin on Gleevec－resistant chronic myeloid leukemia cell line K562/Glv.A:dose－effect relationship (48 h);B:time－effect relationship (0.2 μmol/L). ± s. n =5. * P ＜0.05 vs control (0 μmol/L or 0 h).圖1 鹽霉素對K562/Glv 細胞的生長抑制作用

Figure 2. Salinomycin induced apoptosis of K562/Glv cells.圖2 鹽霉素誘導K562/Glv 細胞凋亡

Figure 3. Effects of salinomycin on mitochondria membrane potential (ΔΨm)，reactive oxygen species(ROS)and intracellular Ca2+ concentration (［Ca2+］i)in K562/Glv cells. ± s. n =5. ＊＊P ＜0.01 vs control(0 h).圖3 鹽霉素對K562/Glv 細胞線粒體膜電位、活性氧和細胞內Ca2+的影響

3 鹽霉素對K562/Glv 細胞caspase－3、caspase－8和caspase－9 活性的影響

結果顯示，0.2 μmol/L 鹽霉素作用K562/Glv 細胞后，caspase－8 和caspase－9 活性在6 h 時已經達到較高水平，而且之后仍然維持在這高水平;caspase－3 活性則隨著時間而增加，呈時間－效應關系，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.01)。這表明鹽霉素通過先激活caspase－8 和caspase－9，再激活caspase－3，從而誘導細胞凋亡，見圖4。

Figure 4. Effects of salinomycin on activity of caspase－3，caspase－8 or caspase－9 in K562/Glv cells. ±s. n=5. ＊＊P ＜0.01 vs control (0 h).圖4 鹽霉素對K562/Glv 細胞caspase－3、caspase－8 或caspase－9 活性的影響

4 鹽霉素對K562/Glv 細胞Bcl－2、Bax、細胞色素C、β－catenin 和p－LRP6 蛋白的影響

結果顯示，0.2 μmol/L 鹽霉素作用K562/Glv 細胞48 h，Bcl－2 表達出現(xiàn)下調、Bax 表達則明顯增加，Bcl－2/Bax 比值顯著降低，同時胞漿細胞色素C顯著增加，β－catenin 和p－LRP6 蛋白水平也顯著下降，見圖5。結果說明鹽霉素不僅通過Bcl－2/Bax和細胞色素C 途徑誘導細胞凋亡，而且通過K562/Glv 細胞抑制細胞增殖。

Figure 5. Effects of salinomycin on the levels of cytochrome C，Bcl－ 2，Bax，β－catenin and p－LRP6 in K562/Glv cells. 1:control;2:salinomycin. ±s.n =5. ＊＊P ＜0.01 vs control.圖5 鹽霉素對K562/Glv 細胞Bcl－2、Bax、細胞色素C、β－catenin和p－LRP6 蛋白的影響

討 論

BCR－ABL 靶點特異藥物格列衛(wèi)是目前CML 治療的一線藥物，但是也不乏有臨床格列衛(wèi)耐藥的現(xiàn)象。殘留的LSC 及原始祖細胞，成為該疾病復發(fā)的主要因素［1，4－5］。所以，尋求新的治療方案以清除腫瘤干細胞、減少耐藥與復發(fā)仍然十分必要。

LSC 由Lapidot 等［6］在急性髓系白血病的研究中首先提出，具有與正常造血干細胞相同的特征，即自我更新、無限繁殖以及多向分化潛能。許多研究表明，Wnt/β－cfatenin 信號途徑在LSCs 中具有重要作用，解釋了傳統(tǒng)化療不能根除白血病的原因［1，7］。所以，尋找抑制該信號途徑并誘導細胞凋亡藥物進行研究具有意義。

最近研究顯示，鹽霉素通過Wnt 信號途徑抑制慢性淋巴細胞白血病細胞增殖并誘導其凋亡［7］。鹽霉素屬于聚醚類一元羧酸，由白色鏈霉菌發(fā)酵產生，具有特殊的環(huán)狀結構，是典型的離子載體抗生素，它對細胞中的陽離子，尤其K+、Na+、Rb+的親和力特別強，使生物所必需的陽離子通過膜上脂質屏障的浸透性增強，妨礙細胞內外陽離子的傳遞，使細胞內外離子濃度發(fā)生變化，從而影響滲透壓，最終使細胞崩解，起到殺菌作用。

本研究結果顯示，鹽霉素不僅通過降低β－catenin 和p－LRP6 蛋白水平抑制耐格列衛(wèi)的K562/Glv細胞生長，而且通過使ΔΨm下降、細胞色素C 和Ca2+的釋放，增加細胞內ROS，以及激活caspase－3、－8 和－9，降低Bcl－2/Bax 比值，誘導細胞凋亡。我們推測其作用本質可能與［Ca2+］i變化有關。Bcl－2 家族、線粒體細胞色素C 及caspase 是細胞內凋亡信號通路的基本成分，而［Ca2+］i變化對它們的活性狀態(tài)調節(jié)具有重要影響［9］。該實驗結果為改善慢性髓系白血病臨床治療方法提供新的依據(jù)。但如何應用鹽霉素于該疾病的臨床治療還有待進一步研究。

［1］ Chen Y，Peng C，Sullivan C，et al. Critical molecular pathways in cancer stem cells of chronic myeloid leukemia［J］. Leukemia，2010，24(9):1545－1554.

［2］ Gupta PB，Onder TT，Jiang G，et al. Identification of selective inhibitors of cancer stem cells by high－throughput screening［J］. Cell，2009，138(4):645－659.

［3］ 曾 葭，劉成成，祝愛珍，等. 鹽霉素抑制人肺腺癌耐順鉑細胞株A549/DDP 增殖及誘導凋亡的機制［J］.中國病理生理雜志，2012，28(5):834－838.

［4］ White DL，Saunders VA，Dang P，et al. OCT－1－mediated influx is a key determinant of the intracellular uptake of imatinib but not nilotinib (AMN107):reduced OCT－1 activity is the cause of low in vitro sensitivity to imatinib［J］. Blood，2006，108(2):697－704.

［5］ Corbin AS，Agarwal A，Loriaux M，et al. Human chronic myeloid leukemia stem cells are insensitive to imatinib despite inhibition of BCR－ABL activity［J］. J Clin Invest，2011，121(1):396－409.

［6］ Lapidot T，Sirard C，Vormor J，et al.A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice［J］.Nature，1994，367(6464):645－648.

［7］ Wang Y，Krivtsov AV，Sinha AU，et al. The Wnt/β－catenin pathway is required for the development of leukemia stem cells in AML［J］. Science，2010，327(5973):1650－1653.

［8］ Lu D，Choi MY，Yu J，et al. Salinomycin inhibits Wnt signaling and selectively induces apoptosis in chronic lymphocytic leukemia cells［J］. Proc Natl Acad Sci U S A，2011，108(32):13253－13257.

［9］ Lalier L，Cartron PF，Juin P，et al. Bax activation and mitochondrial insertion during apoptosis［J］. Apoptosis，2008，12(5):887－896.