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    血管緊張素Ⅱ升高血管內皮細胞中ROS 水平并激活自噬通路*

    2012-12-23 04:07:24楊成明連繼勤曾春雨倪振洪林德勝
    中國病理生理雜志 2012年7期
    關鍵詞:內皮細胞染色心血管

    范 俊, 楊成明△, 連繼勤, 曾春雨, 倪振洪, 林德勝, 冉 希

    (1第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所心血管內科,重慶400042;2第三軍醫(yī)大學基礎部生物化學與分子生物學教研室,重慶400038)

    在高血壓、心肌梗死等心血管疾病的發(fā)生過程 中,血液中血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)的濃度顯著升高[1]。在高濃度AngⅡ的刺激下,血管內皮細胞(vascular endothelial cell)中活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生增加,造成細胞中氧化蛋白和受損線粒體的大量積累,從而導致細胞自身損傷,嚴重影響了血管內皮細胞的屏障功能以及保持血管內膜光滑、調節(jié)血管舒張和收縮、抑制血栓形成等功能,與心血管疾病的發(fā)生密切相關[2-4]。

    隨著近年對細胞自噬(autophagy)研究的深入,發(fā)現(xiàn)自噬可以通過細胞溶酶體系統(tǒng)降解有毒物質以及受損的蛋白質、細胞器,并在營養(yǎng)不足、缺氧等情況下循環(huán)利用降解上述物質釋放出的氨基酸、核苷酸、脂肪酸等小分子物質及能量以維持細胞的穩(wěn)態(tài)[5-7]。由此推測,在由AngⅡ引發(fā)損傷的血管內皮細胞中,自噬可能是防止細胞損傷的一種潛在機制,有可能成為心血管疾病治療的新靶點和新策略[6-7]。目前關于AngⅡ與血管內皮細胞自噬之間關系的研究尚不多見。本研究中,我們觀察了AngⅡ對血管內皮細胞自噬的影響,并初步探討了AngⅡ誘導細胞自噬的可能機制。我們發(fā)現(xiàn)AngⅡ能夠增強血管內皮細胞中ROS 的產(chǎn)生,而且AngⅡ促進自噬的作用可被抗氧化劑所抑制。因此,AngⅡ可能通過升高血管內皮細胞中ROS 水平促進自噬發(fā)生。

    材 料 和 方 法

    1 主要材料

    人臍靜脈細胞融合細胞EA.hy926,由第三軍醫(yī)大學基礎部生物化學教研室保存并贈送。胎牛血清和DMEM 購于Gibco;AngⅡ、N-乙酰半胱氨酸(Nacetyl-L-cysteine,NAC)、吖啶橙(acridine orange,AO)和3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)購自Sigma;活性氧檢測試劑盒購自中國江蘇碧云天公司;微管相關蛋白輕鏈3-Ⅱ(microtubule-associated protein light chain,3-Ⅱ,LC3-Ⅱ)抗體購自Cell signaling;Ⅱ抗購自Santa Cruz。

    2 方法

    2.1 細胞培養(yǎng) 人臍靜脈細胞融合細胞EA.hy926于含10%小牛血清的DMEM 培養(yǎng)基,37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。2 ~3 d 換1 次液,待細胞融合至約80%時,0.25%胰酶消化傳代,2 ~3 代EA 細胞用于實驗。

    2.2 活性氧檢測 取對數(shù)生長期的EA. hy926 細胞,以1 ×107/L 的密度接種96 孔板中,待細胞貼壁后將細胞分為正常對照組、Ang Ⅱ(10-7mol/L)、NAC(50 μmol/L)和AngⅡ(10-7mol/L)+NAC(50 μmol/L),處理24 h 后按照1∶1 000 用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA,使終濃度為10 μmol/L,在37 ℃細胞培養(yǎng)箱內孵育20 min 后,用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3 次,使用熒光酶標儀(488 nm 激發(fā)波長,525 nm 發(fā)射波長)檢測熒光的強弱。

    2.3 吖啶橙染色(acridine orange,AO) 將DMEM(含10 %胎牛血清)培養(yǎng)的EA. hy926 細胞以5 ×107/L 的密度接種12 孔板中,待細胞貼壁后將細胞分為正常對照組、Ang Ⅱ(10-7mol/L)、Ang Ⅱ(10-7mol/L)+3-MA(2 mmol/L)和AngⅡ(10-7mol/L)+NAC(50 μmol/L)組,細胞于終止培養(yǎng)24 h 前20 min,加入吖啶橙染液,終濃度100 μmol/L,避光培養(yǎng)20 min后,用PBS 沖洗2 遍,于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

    2.4 蛋白免疫印跡實驗(Western blotting) 取對數(shù)生長期的EA. hy926 細胞,以5 ×108/L 的密度接種于6 孔板中,待細胞貼壁后加入相應處理因素,處理24 h 后用RIPA 裂解液提取細胞蛋白,BCA 法測蛋白濃度,SDS-PAGE 電泳每孔上樣50 μg 的蛋白后經(jīng)轉膜、封閉,LC3-Ⅱ抗體(1∶1 000)和羊抗兔Ⅱ抗(1∶5 000)孵育后,顯色曝光。

    3 統(tǒng)計學處理

    結 果

    1 EA.hy926 細胞內ROS 水平的檢測

    AngⅡ(10-7mol/L)組較對照組ROS 熒光值顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P <0. 05);而Ang Ⅱ(10-7mol/L)+ NAC(50 μmol/L)組較AngⅡ(10-7mol/L)組顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P <0.05),見圖1。

    Figure 1. The influence of AngⅡ(10 -7 mol/L)combined NAC(50 μmol/L)on ROS level in EA.hy926 cells. ±s.n =6. * P <0.05 vs control group;△P <0.05 vs AngⅡgroup.圖1 AngⅡ對EA.hy926 細胞ROS 水平的影響

    2 AngⅡ促進EA.hy926 細胞發(fā)生自噬

    2.1 不同濃度AngⅡ對EA.hy926 細胞發(fā)生自噬的影響 與對照組相比較,不同濃度Ang Ⅱ對EA.hy926 細胞LC3-Ⅱ蛋白表達有促進作用(P <0.05),且與作用濃度有關,在10-8mol/L 和10-7mol/L 組中,LC3-Ⅱ蛋白表達量明顯高于10-6mol/L 組(P <0. 05),因此,我們在后續(xù)實驗中均采用10-7mol/L 作為AngⅡ的使用劑量,見圖2。

    Figure 2. LC3-Ⅱprotein level detected by Western blotting in EA.hy926 cells after stimulated by different concentrations of AngⅡ. ±s.n=6. * P <0.05 vs 0 mol/L;△P<0.05 vs 10 -6 mol/L.圖2 Western blotting 檢測不同濃度AngⅡ處理后EA.hy926 細胞LC3-Ⅱ蛋白的表達

    2.2 AngⅡ不同作用時間對EA.hy926 細胞發(fā)生自噬的影響 以濃度為10-7mol/L 的AngⅡ分別刺激EA.hy926 細胞0 h、6 h、12 h、24 h 和36 h 后,收集細胞,用Western blotting 檢測LC3-Ⅱ蛋白表達。結果顯示,6 h、12 h、24 h 和36 h 組的LC3-Ⅱ蛋白表達均較0 h 組明顯增強(P <0.05),24 h 組LC3-Ⅱ蛋白表達比6 h、12 h 和36 h 組均明顯增強(P <0.05),見圖3。AngⅡ對EA.hy926 細胞中LC3-Ⅱ蛋白表達的促進作用隨著時間延長逐漸增強,24 h后達到最大。

    Figure 3. LC3-Ⅱprotein level detected by Western blotting in EA.hy926 cells after stimulated by Ang Ⅱ(10 -7mol/L)for different time. ± s. n =6. * P <0.05 vs 0 h;△P <0.05 vs 6 h,12 h or 36 h.圖3 Western blotting 檢測AngⅡ作用不同時間后EA.hy926 細胞LC3-Ⅱ蛋白的表達

    2.3 AO 染色觀察AngⅡ對EA. hy926 細胞自噬的影響 經(jīng)AO 染色后在熒光顯微鏡下觀察EA.hy926 細胞自噬的變化,胞質內呈酸性的自噬體囊泡結構被染成明亮的橘紅色,而其它細胞部位呈綠色。AngⅡ(10-7mol/L)組胞質內橘紅色自噬體結構較對照組明顯增多,見圖4。

    Figure 4. Evaluation of autophagy in EA.hy926 cells by fluorescence microscopy after stained with acridine orange (×200).A:control group;B:AngⅡ(10 -7 mol/L)group.圖4 AO 染色后熒光顯微鏡下觀察EA.hy926 細胞自噬

    3 AngⅡ引起的EA. hy926 細胞自噬可以被3-MA 所抑制

    Rapamycin(陽性對照)和AngⅡ對EA.hy926 細胞LC3-Ⅱ蛋白表達有促進作用(P <0.05),而3-MA 對AngⅡ誘導的LC3-Ⅱ蛋白表達有抑制作用(P <0.05),見圖5。

    4 AngⅡ引起的EA. hy926 細胞自噬可以被NAC所抑制

    4.1 Western blotting 檢測EA.hy926 細胞自噬的變化

    H2O2組的LC3-Ⅱ蛋白表達均較對照組明顯增強(P <0.05),而NAC+H2O2組較H2O2組LC3-Ⅱ蛋白表達有明顯減弱(P <0.05),見圖6A;H2O2(作為陽性對照)組和AngⅡ組的LC3-Ⅱ蛋白表達均較對照組明顯增強(P <0.05),NAC 組較對照組LC3-Ⅱ蛋白無明顯差異(P >0.05),而NAC+AngⅡ組較AngⅡ組LC3-Ⅱ蛋白表達有明顯減弱(P <0.05),見圖6B。

    4.2 AO 染色觀察EA.hy926 細胞自噬的變化 AngⅡ處理組胞質內橘紅色自噬小體較對照組明顯增多,而AngⅡ+3-MA 組和AngⅡ+NAC 組胞質內橘紅色自噬小體較AngⅡ(10-7mol/L)組明顯減少,見圖7。

    Figure 5. LC3-Ⅱprotein level detected by Western blotting in EA. hy926 cells after treated with Ang Ⅱ(10 -7 mol/L),3-MA(2 mmol/L)and rapamycin(Rap,1 mg/L,positive control for autophagy). ± s. n = 6.* P <0.05 vs control group;△P <0. 05 vs Ang Ⅱgroup.圖5 Western blotting 檢測AngⅡ聯(lián)合3-MA 處理后EA細胞LC3-Ⅱ蛋白的表達

    Figure 6. Expression of LC3-Ⅱprotein in different groups detected by Western blotting.A:LC3-Ⅱprotein level in EA.hy926 cells after treated with H2O2(200 μmol/L)and/or NAC(50 μmol/L). ± s. n =6. * P <0.05 vs control and H2O2 + NAC group.B:LC3-Ⅱprotein level in EA.hy926 cells after treated with AngⅡ(10 -7 mol/L)and/or NAC(50 μmol/L).H2O2(200 μmol/L)served as a positive control for autophagy. ±s. n =6. #P <0.05 vs control group;△P <0.05 vs AngⅡgroup.圖6 Western blotting 檢測各組EA.hy926 細胞LC3-Ⅱ蛋白的表達

    Figure 7. Evaluation of autophagy in EA.hy926 cells by fluorescence microscopy after stained with acridine orange (×200).A:control group;B:AngⅡ(10 -7 mol/L)group;C:AngⅡ+3-MA(2 mmol/L)group;D:AngⅡ+NAC(50 μmol/L)group.圖7 AO 染色后熒光顯微鏡觀察EA.hy926 細胞自噬

    討 論

    血管內皮細胞在維持正常的血管功能和結構中具有關鍵性作用,內皮功能損傷是多種心血管疾病的關鍵環(huán)節(jié)[8]。AngⅡ作為引起氧化應激最強烈的刺激物之一,在心血管疾病發(fā)生過程中明顯升高。AngⅡ在多種酶如黃嘌呤氧化酶、細胞色素P450、一氧化氮合酶、NADPH 氧化酶等參與下,主要通過其I型受體介導血管內皮細胞產(chǎn)生過多的ROS,從而導致了內皮功能損傷[2,4,9]。因此,ROS 水平升高是AngⅡ引起內皮功能損傷的主要原因。本研究發(fā)現(xiàn)高于生理濃度(10-7mol/L)的AngⅡ作用于EA 細胞24h 后,與對照組相比,細胞內ROS 水平均明顯升高(均P <0.05);而NAC 組和AngⅡ+NAC 組,與AngⅡ組相比,細胞內ROS 水平明顯降低(均P <0.05)。這些結果再次證實了AngⅡ能夠引起血管內皮細胞內ROS 的產(chǎn)生增加。

    自噬作為真核細胞通過溶酶體系統(tǒng)降解自身成分的一個高度保守的代謝過程,其對于清除聚集的氧化蛋白和受損的細胞器以及維持細胞的穩(wěn)態(tài)具有非常重要的作用[10]。因此,自噬是保護血管內皮細胞免受ROS 損傷的重要機制。在自噬過程中LC3蛋白發(fā)揮了重要作用,以LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ2 種形式存在,其中LC3-Ⅰ為非活化形式,主要存在于胞質中;LC3-Ⅰ在自噬發(fā)生時與磷脂酰乙醇胺結合轉變?yōu)長C3-Ⅱ并結合于自噬體膜上,對自噬體的延伸及最終的閉合起著重要作用,且LC3-Ⅱ一直定位在自噬體膜上直至被溶酶體酶降解,是目前反映細胞內自噬水平的特異性蛋白標記物[11-13]。為了研究AngⅡ對血管內皮細胞自噬的影響,本實驗選擇3 個高于正常生理濃度的Ang Ⅱ干預體外培養(yǎng)的EA.hy926 細胞,同時以濃度為10-7mol/L 的AngⅡ分別刺激EA. hy926 細胞不同時間后,通過Western blotting 檢測LC3-Ⅱ蛋白的表達變化,并通過AO染色觀察自噬體的形成。我們發(fā)現(xiàn)AngⅡ對EA 細胞LC3-Ⅱ蛋白表達有促進作用,并且能夠促進自噬體的形成,這些結果均證明了AngⅡ能夠誘導血管內皮細胞發(fā)生自噬。實驗還發(fā)現(xiàn),與10-6mol/L 作用相比,10-8與10-7mol/L 的AngⅡ對EA 細胞的自噬誘導作用更強烈,表明EA 細胞自噬水平的強弱與AngⅡ濃度的高低并不完全成正比關系,相關機制尚需進一步研究探討。

    3-MA 是細胞內I 型與Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶的特殊性抑制劑,這兩種酶的活性尤其是Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶的活性與細胞自噬的發(fā)生密切相關,因此,3-MA 通常作為細胞自噬的特異性抑制劑[14-15]。本實驗結果提示,3-MA 聯(lián)合AngⅡ作用于EA.hy926 細胞后能夠明顯抑制AngⅡ誘導的細胞自噬,并且AO 染色也發(fā)現(xiàn)AngⅡ聯(lián)合3-MA 作用EA.hy926 細胞后,胞質內自噬體(橘紅色點狀結構)較AngⅡ組明顯減少,自噬水平顯著降低,說明AngⅡ誘導的EA 細胞自噬依賴于Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶的激活。

    多項研究表明,氧化應激是誘導細胞自噬發(fā)生的重要原因[13,16-17]。為了確定AngⅡ誘導的氧化應激與細胞自噬之間是否存在因果關系,本實驗選擇特異性抗氧化劑NAC[18]聯(lián)合H2O2或AngⅡ作用于EA.hy926 細胞后檢測其自噬水平。結果表明,NAC可以明顯抑制H2O2或AngⅡ誘導細胞自噬水平,并且AO 染色也發(fā)現(xiàn)AngⅡ聯(lián)合NAC 作用EA. hy926細胞后,胞質內自噬體(橘紅色點狀結構)較AngⅡ組明顯減少,說明ROS 水平升高可能是AngⅡ誘導EA.hy926 細胞發(fā)生自噬的主要原因。

    目前,自噬與心血管疾病關系的研究已成為一個新的熱點,雖然還存在很多未知因素,但對AngⅡ、ROS 和自噬三者間關系了解的不斷深入,將有助于研究者根據(jù)不同心血管疾病發(fā)生過程中細胞自噬水平的特點和變化,發(fā)現(xiàn)新的治療靶點和防治策略。

    [1] De Mello WC,Danser AH. AngiotensinⅡand the heart:on the intracrine renin-angiotensin system[J]. Hypertension,2000,35(6):1183-1188.

    [2] Landmesser U,Spiekermann S,Preuss C,et al. AngiotensinⅡinduces endothelial xanthine oxidase activation:role for endothelial dysfunction in patients with coronary disease[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol,2007,27(4):943-948.

    [3] Cai H,Harrison DG. Endothelial dysfunction in cardiovascular diseases:the role of oxidant stress[J]. Circ Res,2000,87(10):840-844.

    [4] 尤壽江,石際俊,張艷林. ROS 介導的自噬及其在相關疾病中的作用[J]. 中國病理生理雜志,2011,27(1):187-190,195.

    [5] Baehrecke EH. Autophagy:dual roles in life and death?[J]. Nat Rev Mol Cell Biol,2005,6(6):505-510.

    [6] Nishida K,Kyoi S,Yamaguchi O,et al. The role of autophagy in the heart[J]. Cell Death Differ,2009,16(1):31-38.

    [7] De Meyer GR,Martinet W. Autophagy in the cardiovascular system[J]. Biochim Biophys Acta,2009,1793(9):1485-1495.

    [8] Cines DB,Pollak ES,Buck CA,et al. Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders[J]. Blood,1998,91(10):3527-3561.

    [9] Doughan AK,Harrison DG,Dikalov SI. Molecular mechanisms of angiotensin Ⅱ- mediated mitochondrial dysfunction:linking mitochondrial oxidative damage and vascular endothelial dysfunction[J]. Circ Res,2008,102(4):488-496.

    [10] Levine B,Kroemer G. Autophagy in the pathogenesis of disease[J]. Cell,2008,132(1):27-42.

    [11] Kabeya Y,Mizushima N,Ueno T,et al. LC3,a mammalian homologue of yeast Apg8p,is localized in autophagosome membranes after processing[J]. EMBO J,2000,19(21):5720-5728.

    [12]Mizushima N,Yoshimori T,Levine B. Methods in mammalian autophagy research[J]. Cell,2010,140(3):313-326.

    [13] He C,Klionsky DJ. Regulation mechanisms and signaling pathways of autophagy[J]. Annu Rev Genet,2009,43:67-93.

    [14] Blommaart EF,Krause U,Schellens JP,et al. The phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors wortmannin and LY294002 inhibit autophagy in isolated rat hepatocytes[J]. Eur J Biochem,1997,243(1-2):240-246.

    [15] Petiot A,Ogier-Denis E,Blommaart EF,et al. Distinct classes of phosphatidylinositol 3'-kinases are involved in signaling pathways that control macroautophagy in HT-29 cells[J]. J Biol Chem,2000,275(2):992-998.

    [16] Zheng L,Marcusson J,Terman A. Oxidative stress and Alzheimer disease:the autophagy connection?[J]. Autophagy,2006,2(2):143-145.

    [17] Kiffin R,Bandyopadhyay U,Cuervo AM. Oxidative stress and autophagy[J]. Antioxid Redox Signal,2006,8(1-2):152-162.

    [18] De Vries N,De Flora S. N-acetyl-L-cysteine[J]. J Cell Biochem Suppl,1993,17F:270-277.

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