• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    血管緊張素Ⅱ升高血管內皮細胞中ROS 水平并激活自噬通路*

    2012-12-23 04:07:24楊成明連繼勤曾春雨倪振洪林德勝
    中國病理生理雜志 2012年7期
    關鍵詞:內皮細胞染色心血管

    范 俊, 楊成明△, 連繼勤, 曾春雨, 倪振洪, 林德勝, 冉 希

    (1第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所心血管內科,重慶400042;2第三軍醫(yī)大學基礎部生物化學與分子生物學教研室,重慶400038)

    在高血壓、心肌梗死等心血管疾病的發(fā)生過程 中,血液中血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)的濃度顯著升高[1]。在高濃度AngⅡ的刺激下,血管內皮細胞(vascular endothelial cell)中活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生增加,造成細胞中氧化蛋白和受損線粒體的大量積累,從而導致細胞自身損傷,嚴重影響了血管內皮細胞的屏障功能以及保持血管內膜光滑、調節(jié)血管舒張和收縮、抑制血栓形成等功能,與心血管疾病的發(fā)生密切相關[2-4]。

    隨著近年對細胞自噬(autophagy)研究的深入,發(fā)現(xiàn)自噬可以通過細胞溶酶體系統(tǒng)降解有毒物質以及受損的蛋白質、細胞器,并在營養(yǎng)不足、缺氧等情況下循環(huán)利用降解上述物質釋放出的氨基酸、核苷酸、脂肪酸等小分子物質及能量以維持細胞的穩(wěn)態(tài)[5-7]。由此推測,在由AngⅡ引發(fā)損傷的血管內皮細胞中,自噬可能是防止細胞損傷的一種潛在機制,有可能成為心血管疾病治療的新靶點和新策略[6-7]。目前關于AngⅡ與血管內皮細胞自噬之間關系的研究尚不多見。本研究中,我們觀察了AngⅡ對血管內皮細胞自噬的影響,并初步探討了AngⅡ誘導細胞自噬的可能機制。我們發(fā)現(xiàn)AngⅡ能夠增強血管內皮細胞中ROS 的產(chǎn)生,而且AngⅡ促進自噬的作用可被抗氧化劑所抑制。因此,AngⅡ可能通過升高血管內皮細胞中ROS 水平促進自噬發(fā)生。

    材 料 和 方 法

    1 主要材料

    人臍靜脈細胞融合細胞EA.hy926,由第三軍醫(yī)大學基礎部生物化學教研室保存并贈送。胎牛血清和DMEM 購于Gibco;AngⅡ、N-乙酰半胱氨酸(Nacetyl-L-cysteine,NAC)、吖啶橙(acridine orange,AO)和3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)購自Sigma;活性氧檢測試劑盒購自中國江蘇碧云天公司;微管相關蛋白輕鏈3-Ⅱ(microtubule-associated protein light chain,3-Ⅱ,LC3-Ⅱ)抗體購自Cell signaling;Ⅱ抗購自Santa Cruz。

    2 方法

    2.1 細胞培養(yǎng) 人臍靜脈細胞融合細胞EA.hy926于含10%小牛血清的DMEM 培養(yǎng)基,37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。2 ~3 d 換1 次液,待細胞融合至約80%時,0.25%胰酶消化傳代,2 ~3 代EA 細胞用于實驗。

    2.2 活性氧檢測 取對數(shù)生長期的EA. hy926 細胞,以1 ×107/L 的密度接種96 孔板中,待細胞貼壁后將細胞分為正常對照組、Ang Ⅱ(10-7mol/L)、NAC(50 μmol/L)和AngⅡ(10-7mol/L)+NAC(50 μmol/L),處理24 h 后按照1∶1 000 用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA,使終濃度為10 μmol/L,在37 ℃細胞培養(yǎng)箱內孵育20 min 后,用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3 次,使用熒光酶標儀(488 nm 激發(fā)波長,525 nm 發(fā)射波長)檢測熒光的強弱。

    2.3 吖啶橙染色(acridine orange,AO) 將DMEM(含10 %胎牛血清)培養(yǎng)的EA. hy926 細胞以5 ×107/L 的密度接種12 孔板中,待細胞貼壁后將細胞分為正常對照組、Ang Ⅱ(10-7mol/L)、Ang Ⅱ(10-7mol/L)+3-MA(2 mmol/L)和AngⅡ(10-7mol/L)+NAC(50 μmol/L)組,細胞于終止培養(yǎng)24 h 前20 min,加入吖啶橙染液,終濃度100 μmol/L,避光培養(yǎng)20 min后,用PBS 沖洗2 遍,于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

    2.4 蛋白免疫印跡實驗(Western blotting) 取對數(shù)生長期的EA. hy926 細胞,以5 ×108/L 的密度接種于6 孔板中,待細胞貼壁后加入相應處理因素,處理24 h 后用RIPA 裂解液提取細胞蛋白,BCA 法測蛋白濃度,SDS-PAGE 電泳每孔上樣50 μg 的蛋白后經(jīng)轉膜、封閉,LC3-Ⅱ抗體(1∶1 000)和羊抗兔Ⅱ抗(1∶5 000)孵育后,顯色曝光。

    3 統(tǒng)計學處理

    結 果

    1 EA.hy926 細胞內ROS 水平的檢測

    AngⅡ(10-7mol/L)組較對照組ROS 熒光值顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P <0. 05);而Ang Ⅱ(10-7mol/L)+ NAC(50 μmol/L)組較AngⅡ(10-7mol/L)組顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P <0.05),見圖1。

    Figure 1. The influence of AngⅡ(10 -7 mol/L)combined NAC(50 μmol/L)on ROS level in EA.hy926 cells. ±s.n =6. * P <0.05 vs control group;△P <0.05 vs AngⅡgroup.圖1 AngⅡ對EA.hy926 細胞ROS 水平的影響

    2 AngⅡ促進EA.hy926 細胞發(fā)生自噬

    2.1 不同濃度AngⅡ對EA.hy926 細胞發(fā)生自噬的影響 與對照組相比較,不同濃度Ang Ⅱ對EA.hy926 細胞LC3-Ⅱ蛋白表達有促進作用(P <0.05),且與作用濃度有關,在10-8mol/L 和10-7mol/L 組中,LC3-Ⅱ蛋白表達量明顯高于10-6mol/L 組(P <0. 05),因此,我們在后續(xù)實驗中均采用10-7mol/L 作為AngⅡ的使用劑量,見圖2。

    Figure 2. LC3-Ⅱprotein level detected by Western blotting in EA.hy926 cells after stimulated by different concentrations of AngⅡ. ±s.n=6. * P <0.05 vs 0 mol/L;△P<0.05 vs 10 -6 mol/L.圖2 Western blotting 檢測不同濃度AngⅡ處理后EA.hy926 細胞LC3-Ⅱ蛋白的表達

    2.2 AngⅡ不同作用時間對EA.hy926 細胞發(fā)生自噬的影響 以濃度為10-7mol/L 的AngⅡ分別刺激EA.hy926 細胞0 h、6 h、12 h、24 h 和36 h 后,收集細胞,用Western blotting 檢測LC3-Ⅱ蛋白表達。結果顯示,6 h、12 h、24 h 和36 h 組的LC3-Ⅱ蛋白表達均較0 h 組明顯增強(P <0.05),24 h 組LC3-Ⅱ蛋白表達比6 h、12 h 和36 h 組均明顯增強(P <0.05),見圖3。AngⅡ對EA.hy926 細胞中LC3-Ⅱ蛋白表達的促進作用隨著時間延長逐漸增強,24 h后達到最大。

    Figure 3. LC3-Ⅱprotein level detected by Western blotting in EA.hy926 cells after stimulated by Ang Ⅱ(10 -7mol/L)for different time. ± s. n =6. * P <0.05 vs 0 h;△P <0.05 vs 6 h,12 h or 36 h.圖3 Western blotting 檢測AngⅡ作用不同時間后EA.hy926 細胞LC3-Ⅱ蛋白的表達

    2.3 AO 染色觀察AngⅡ對EA. hy926 細胞自噬的影響 經(jīng)AO 染色后在熒光顯微鏡下觀察EA.hy926 細胞自噬的變化,胞質內呈酸性的自噬體囊泡結構被染成明亮的橘紅色,而其它細胞部位呈綠色。AngⅡ(10-7mol/L)組胞質內橘紅色自噬體結構較對照組明顯增多,見圖4。

    Figure 4. Evaluation of autophagy in EA.hy926 cells by fluorescence microscopy after stained with acridine orange (×200).A:control group;B:AngⅡ(10 -7 mol/L)group.圖4 AO 染色后熒光顯微鏡下觀察EA.hy926 細胞自噬

    3 AngⅡ引起的EA. hy926 細胞自噬可以被3-MA 所抑制

    Rapamycin(陽性對照)和AngⅡ對EA.hy926 細胞LC3-Ⅱ蛋白表達有促進作用(P <0.05),而3-MA 對AngⅡ誘導的LC3-Ⅱ蛋白表達有抑制作用(P <0.05),見圖5。

    4 AngⅡ引起的EA. hy926 細胞自噬可以被NAC所抑制

    4.1 Western blotting 檢測EA.hy926 細胞自噬的變化

    H2O2組的LC3-Ⅱ蛋白表達均較對照組明顯增強(P <0.05),而NAC+H2O2組較H2O2組LC3-Ⅱ蛋白表達有明顯減弱(P <0.05),見圖6A;H2O2(作為陽性對照)組和AngⅡ組的LC3-Ⅱ蛋白表達均較對照組明顯增強(P <0.05),NAC 組較對照組LC3-Ⅱ蛋白無明顯差異(P >0.05),而NAC+AngⅡ組較AngⅡ組LC3-Ⅱ蛋白表達有明顯減弱(P <0.05),見圖6B。

    4.2 AO 染色觀察EA.hy926 細胞自噬的變化 AngⅡ處理組胞質內橘紅色自噬小體較對照組明顯增多,而AngⅡ+3-MA 組和AngⅡ+NAC 組胞質內橘紅色自噬小體較AngⅡ(10-7mol/L)組明顯減少,見圖7。

    Figure 5. LC3-Ⅱprotein level detected by Western blotting in EA. hy926 cells after treated with Ang Ⅱ(10 -7 mol/L),3-MA(2 mmol/L)and rapamycin(Rap,1 mg/L,positive control for autophagy). ± s. n = 6.* P <0.05 vs control group;△P <0. 05 vs Ang Ⅱgroup.圖5 Western blotting 檢測AngⅡ聯(lián)合3-MA 處理后EA細胞LC3-Ⅱ蛋白的表達

    Figure 6. Expression of LC3-Ⅱprotein in different groups detected by Western blotting.A:LC3-Ⅱprotein level in EA.hy926 cells after treated with H2O2(200 μmol/L)and/or NAC(50 μmol/L). ± s. n =6. * P <0.05 vs control and H2O2 + NAC group.B:LC3-Ⅱprotein level in EA.hy926 cells after treated with AngⅡ(10 -7 mol/L)and/or NAC(50 μmol/L).H2O2(200 μmol/L)served as a positive control for autophagy. ±s. n =6. #P <0.05 vs control group;△P <0.05 vs AngⅡgroup.圖6 Western blotting 檢測各組EA.hy926 細胞LC3-Ⅱ蛋白的表達

    Figure 7. Evaluation of autophagy in EA.hy926 cells by fluorescence microscopy after stained with acridine orange (×200).A:control group;B:AngⅡ(10 -7 mol/L)group;C:AngⅡ+3-MA(2 mmol/L)group;D:AngⅡ+NAC(50 μmol/L)group.圖7 AO 染色后熒光顯微鏡觀察EA.hy926 細胞自噬

    討 論

    血管內皮細胞在維持正常的血管功能和結構中具有關鍵性作用,內皮功能損傷是多種心血管疾病的關鍵環(huán)節(jié)[8]。AngⅡ作為引起氧化應激最強烈的刺激物之一,在心血管疾病發(fā)生過程中明顯升高。AngⅡ在多種酶如黃嘌呤氧化酶、細胞色素P450、一氧化氮合酶、NADPH 氧化酶等參與下,主要通過其I型受體介導血管內皮細胞產(chǎn)生過多的ROS,從而導致了內皮功能損傷[2,4,9]。因此,ROS 水平升高是AngⅡ引起內皮功能損傷的主要原因。本研究發(fā)現(xiàn)高于生理濃度(10-7mol/L)的AngⅡ作用于EA 細胞24h 后,與對照組相比,細胞內ROS 水平均明顯升高(均P <0.05);而NAC 組和AngⅡ+NAC 組,與AngⅡ組相比,細胞內ROS 水平明顯降低(均P <0.05)。這些結果再次證實了AngⅡ能夠引起血管內皮細胞內ROS 的產(chǎn)生增加。

    自噬作為真核細胞通過溶酶體系統(tǒng)降解自身成分的一個高度保守的代謝過程,其對于清除聚集的氧化蛋白和受損的細胞器以及維持細胞的穩(wěn)態(tài)具有非常重要的作用[10]。因此,自噬是保護血管內皮細胞免受ROS 損傷的重要機制。在自噬過程中LC3蛋白發(fā)揮了重要作用,以LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ2 種形式存在,其中LC3-Ⅰ為非活化形式,主要存在于胞質中;LC3-Ⅰ在自噬發(fā)生時與磷脂酰乙醇胺結合轉變?yōu)長C3-Ⅱ并結合于自噬體膜上,對自噬體的延伸及最終的閉合起著重要作用,且LC3-Ⅱ一直定位在自噬體膜上直至被溶酶體酶降解,是目前反映細胞內自噬水平的特異性蛋白標記物[11-13]。為了研究AngⅡ對血管內皮細胞自噬的影響,本實驗選擇3 個高于正常生理濃度的Ang Ⅱ干預體外培養(yǎng)的EA.hy926 細胞,同時以濃度為10-7mol/L 的AngⅡ分別刺激EA. hy926 細胞不同時間后,通過Western blotting 檢測LC3-Ⅱ蛋白的表達變化,并通過AO染色觀察自噬體的形成。我們發(fā)現(xiàn)AngⅡ對EA 細胞LC3-Ⅱ蛋白表達有促進作用,并且能夠促進自噬體的形成,這些結果均證明了AngⅡ能夠誘導血管內皮細胞發(fā)生自噬。實驗還發(fā)現(xiàn),與10-6mol/L 作用相比,10-8與10-7mol/L 的AngⅡ對EA 細胞的自噬誘導作用更強烈,表明EA 細胞自噬水平的強弱與AngⅡ濃度的高低并不完全成正比關系,相關機制尚需進一步研究探討。

    3-MA 是細胞內I 型與Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶的特殊性抑制劑,這兩種酶的活性尤其是Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶的活性與細胞自噬的發(fā)生密切相關,因此,3-MA 通常作為細胞自噬的特異性抑制劑[14-15]。本實驗結果提示,3-MA 聯(lián)合AngⅡ作用于EA.hy926 細胞后能夠明顯抑制AngⅡ誘導的細胞自噬,并且AO 染色也發(fā)現(xiàn)AngⅡ聯(lián)合3-MA 作用EA.hy926 細胞后,胞質內自噬體(橘紅色點狀結構)較AngⅡ組明顯減少,自噬水平顯著降低,說明AngⅡ誘導的EA 細胞自噬依賴于Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶的激活。

    多項研究表明,氧化應激是誘導細胞自噬發(fā)生的重要原因[13,16-17]。為了確定AngⅡ誘導的氧化應激與細胞自噬之間是否存在因果關系,本實驗選擇特異性抗氧化劑NAC[18]聯(lián)合H2O2或AngⅡ作用于EA.hy926 細胞后檢測其自噬水平。結果表明,NAC可以明顯抑制H2O2或AngⅡ誘導細胞自噬水平,并且AO 染色也發(fā)現(xiàn)AngⅡ聯(lián)合NAC 作用EA. hy926細胞后,胞質內自噬體(橘紅色點狀結構)較AngⅡ組明顯減少,說明ROS 水平升高可能是AngⅡ誘導EA.hy926 細胞發(fā)生自噬的主要原因。

    目前,自噬與心血管疾病關系的研究已成為一個新的熱點,雖然還存在很多未知因素,但對AngⅡ、ROS 和自噬三者間關系了解的不斷深入,將有助于研究者根據(jù)不同心血管疾病發(fā)生過程中細胞自噬水平的特點和變化,發(fā)現(xiàn)新的治療靶點和防治策略。

    [1] De Mello WC,Danser AH. AngiotensinⅡand the heart:on the intracrine renin-angiotensin system[J]. Hypertension,2000,35(6):1183-1188.

    [2] Landmesser U,Spiekermann S,Preuss C,et al. AngiotensinⅡinduces endothelial xanthine oxidase activation:role for endothelial dysfunction in patients with coronary disease[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol,2007,27(4):943-948.

    [3] Cai H,Harrison DG. Endothelial dysfunction in cardiovascular diseases:the role of oxidant stress[J]. Circ Res,2000,87(10):840-844.

    [4] 尤壽江,石際俊,張艷林. ROS 介導的自噬及其在相關疾病中的作用[J]. 中國病理生理雜志,2011,27(1):187-190,195.

    [5] Baehrecke EH. Autophagy:dual roles in life and death?[J]. Nat Rev Mol Cell Biol,2005,6(6):505-510.

    [6] Nishida K,Kyoi S,Yamaguchi O,et al. The role of autophagy in the heart[J]. Cell Death Differ,2009,16(1):31-38.

    [7] De Meyer GR,Martinet W. Autophagy in the cardiovascular system[J]. Biochim Biophys Acta,2009,1793(9):1485-1495.

    [8] Cines DB,Pollak ES,Buck CA,et al. Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders[J]. Blood,1998,91(10):3527-3561.

    [9] Doughan AK,Harrison DG,Dikalov SI. Molecular mechanisms of angiotensin Ⅱ- mediated mitochondrial dysfunction:linking mitochondrial oxidative damage and vascular endothelial dysfunction[J]. Circ Res,2008,102(4):488-496.

    [10] Levine B,Kroemer G. Autophagy in the pathogenesis of disease[J]. Cell,2008,132(1):27-42.

    [11] Kabeya Y,Mizushima N,Ueno T,et al. LC3,a mammalian homologue of yeast Apg8p,is localized in autophagosome membranes after processing[J]. EMBO J,2000,19(21):5720-5728.

    [12]Mizushima N,Yoshimori T,Levine B. Methods in mammalian autophagy research[J]. Cell,2010,140(3):313-326.

    [13] He C,Klionsky DJ. Regulation mechanisms and signaling pathways of autophagy[J]. Annu Rev Genet,2009,43:67-93.

    [14] Blommaart EF,Krause U,Schellens JP,et al. The phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors wortmannin and LY294002 inhibit autophagy in isolated rat hepatocytes[J]. Eur J Biochem,1997,243(1-2):240-246.

    [15] Petiot A,Ogier-Denis E,Blommaart EF,et al. Distinct classes of phosphatidylinositol 3'-kinases are involved in signaling pathways that control macroautophagy in HT-29 cells[J]. J Biol Chem,2000,275(2):992-998.

    [16] Zheng L,Marcusson J,Terman A. Oxidative stress and Alzheimer disease:the autophagy connection?[J]. Autophagy,2006,2(2):143-145.

    [17] Kiffin R,Bandyopadhyay U,Cuervo AM. Oxidative stress and autophagy[J]. Antioxid Redox Signal,2006,8(1-2):152-162.

    [18] De Vries N,De Flora S. N-acetyl-L-cysteine[J]. J Cell Biochem Suppl,1993,17F:270-277.

    猜你喜歡
    內皮細胞染色心血管
    COVID-19心血管并發(fā)癥的研究進展
    淺議角膜內皮細胞檢查
    平面圖的3-hued 染色
    雌激素治療保護去卵巢對血管內皮細胞損傷的初步機制
    簡單圖mC4的點可區(qū)別V-全染色
    油紅O染色在斑馬魚體內脂質染色中的應用
    細胞微泡miRNA對內皮細胞的調控
    lncRNA與心血管疾病
    胱抑素C與心血管疾病的相關性
    兩類冪圖的強邊染色
    最黄视频免费看| 中文精品一卡2卡3卡4更新| freevideosex欧美| 国产一区二区在线观看日韩| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 高清欧美精品videossex| 在线观看免费高清a一片| 成人影院久久| 日韩三级伦理在线观看| 精品午夜福利在线看| 精品久久久久久久久av| 亚洲综合色惰| 国产一区亚洲一区在线观看| 亚洲精品色激情综合| 一级片'在线观看视频| 91在线精品国自产拍蜜月| 亚洲精品av麻豆狂野| 最近中文字幕高清免费大全6| 午夜免费鲁丝| 卡戴珊不雅视频在线播放| 最近手机中文字幕大全| 免费黄色在线免费观看| 美女cb高潮喷水在线观看| av在线播放精品| 大片免费播放器 马上看| 少妇的逼好多水| 欧美另类一区| 中文精品一卡2卡3卡4更新| av又黄又爽大尺度在线免费看| 91久久精品国产一区二区三区| 亚洲av福利一区| 日韩三级伦理在线观看| 亚洲国产欧美在线一区| 大片电影免费在线观看免费| 久久久久久久久大av| 日韩伦理黄色片| 超色免费av| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 欧美xxⅹ黑人| 亚洲欧美精品自产自拍| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 成人毛片a级毛片在线播放| 男女边摸边吃奶| 婷婷色综合大香蕉| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 搡女人真爽免费视频火全软件| 又大又黄又爽视频免费| 爱豆传媒免费全集在线观看| 男女高潮啪啪啪动态图| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | av有码第一页| 女人精品久久久久毛片| 最后的刺客免费高清国语| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 欧美三级亚洲精品| 日韩中文字幕视频在线看片| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 免费av不卡在线播放| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 亚洲精品av麻豆狂野| 亚洲精品国产av蜜桃| 国产欧美亚洲国产| 美女主播在线视频| 免费观看无遮挡的男女| 久久久久久人妻| 国产69精品久久久久777片| h视频一区二区三区| 三级国产精品欧美在线观看| 中国国产av一级| 日本黄色片子视频| 欧美激情 高清一区二区三区| 婷婷色麻豆天堂久久| 激情五月婷婷亚洲| 一边摸一边做爽爽视频免费| 91精品三级在线观看| 午夜av观看不卡| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 内地一区二区视频在线| 免费高清在线观看日韩| 99热网站在线观看| 亚洲精品国产av成人精品| 亚洲欧美色中文字幕在线| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 99久久精品国产国产毛片| 亚洲人成网站在线播| 精品人妻熟女av久视频| 午夜激情久久久久久久| 男女边吃奶边做爰视频| 国产男女内射视频| 久久午夜综合久久蜜桃| 一二三四中文在线观看免费高清| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 欧美3d第一页| 在线观看免费视频网站a站| 看十八女毛片水多多多| 一区二区av电影网| 99久久精品国产国产毛片| 亚洲三级黄色毛片| 男女啪啪激烈高潮av片| 久久综合国产亚洲精品| 国产精品久久久久久精品古装| 伊人久久精品亚洲午夜| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 精品亚洲成国产av| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 2018国产大陆天天弄谢| 久久久久国产精品人妻一区二区| 国产免费现黄频在线看| 爱豆传媒免费全集在线观看| 热re99久久精品国产66热6| 岛国毛片在线播放| 成人国产av品久久久| 精品人妻在线不人妻| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 综合色丁香网| 午夜福利视频在线观看免费| 一区二区三区精品91| xxxhd国产人妻xxx| 99久久人妻综合| 天堂中文最新版在线下载| 国产男女内射视频| 妹子高潮喷水视频| 免费av不卡在线播放| 大码成人一级视频| 久久久久国产精品人妻一区二区| 国产免费现黄频在线看| 欧美精品国产亚洲| 亚洲五月色婷婷综合| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 亚洲av男天堂| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 十八禁网站网址无遮挡| 99热国产这里只有精品6| 丰满少妇做爰视频| 国产淫语在线视频| 91国产中文字幕| 亚洲色图综合在线观看| 99久久人妻综合| 我的老师免费观看完整版| 亚洲精品国产色婷婷电影| 蜜桃国产av成人99| 国产高清不卡午夜福利| 97在线视频观看| 韩国高清视频一区二区三区| 99国产综合亚洲精品| av免费在线看不卡| 美女国产高潮福利片在线看| 尾随美女入室| 国产精品人妻久久久影院| 久久久久国产精品人妻一区二区| 久久久久久久久久人人人人人人| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 国产成人aa在线观看| 人妻一区二区av| 久久久久精品久久久久真实原创| 亚洲欧美一区二区三区国产| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 亚洲国产av新网站| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产欧美亚洲国产| 午夜激情久久久久久久| 国产精品久久久久久精品古装| 大陆偷拍与自拍| 高清av免费在线| 999精品在线视频| 大陆偷拍与自拍| a级毛片免费高清观看在线播放| 999精品在线视频| 国产熟女欧美一区二区| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 亚洲,欧美,日韩| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 97在线视频观看| 午夜精品国产一区二区电影| 亚洲av欧美aⅴ国产| av在线播放精品| 亚洲第一av免费看| 国产精品偷伦视频观看了| 卡戴珊不雅视频在线播放| 男人添女人高潮全过程视频| 视频区图区小说| 日韩亚洲欧美综合| 伦精品一区二区三区| 我的女老师完整版在线观看| 超碰97精品在线观看| 国产av精品麻豆| 久久久精品94久久精品| 内地一区二区视频在线| 国产精品 国内视频| 久久精品久久精品一区二区三区| h视频一区二区三区| 亚洲天堂av无毛| 伦精品一区二区三区| 少妇人妻久久综合中文| 国产 精品1| 看免费成人av毛片| 精品久久久久久久久av| 亚洲av不卡在线观看| 亚洲精品aⅴ在线观看| 日本av手机在线免费观看| 丝袜喷水一区| 最新中文字幕久久久久| 成年人午夜在线观看视频| 尾随美女入室| 国产亚洲欧美精品永久| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产成人精品无人区| 综合色丁香网| 精品一品国产午夜福利视频| 久久久久久伊人网av| 亚洲五月色婷婷综合| 夫妻性生交免费视频一级片| 最近中文字幕高清免费大全6| 日本欧美视频一区| 少妇丰满av| 九色亚洲精品在线播放| 亚洲在久久综合| 一本色道久久久久久精品综合| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 高清午夜精品一区二区三区| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 久久久久久久亚洲中文字幕| 免费观看av网站的网址| 色吧在线观看| 国产精品女同一区二区软件| 黄色毛片三级朝国网站| 免费黄色在线免费观看| tube8黄色片| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 日韩大片免费观看网站| 国产精品久久久久成人av| 狂野欧美激情性bbbbbb| 一级毛片aaaaaa免费看小| 久久久久久久久久久久大奶| 日韩av免费高清视频| 在线免费观看不下载黄p国产| 久久av网站| 一区在线观看完整版| 观看美女的网站| 亚洲精品中文字幕在线视频| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 久热久热在线精品观看| 国产成人精品在线电影| 亚洲精品色激情综合| 日本爱情动作片www.在线观看| videos熟女内射| 免费观看a级毛片全部| 国产在视频线精品| 日本黄色日本黄色录像| 国国产精品蜜臀av免费| 乱码一卡2卡4卡精品| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 国产黄色免费在线视频| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 少妇高潮的动态图| 男女国产视频网站| 日本欧美视频一区| 色婷婷av一区二区三区视频| 在线观看www视频免费| 男女免费视频国产| 亚洲高清免费不卡视频| 日韩成人伦理影院| 一边亲一边摸免费视频| av在线app专区| 制服诱惑二区| 啦啦啦啦在线视频资源| 22中文网久久字幕| 高清欧美精品videossex| 五月开心婷婷网| av天堂久久9| 日韩视频在线欧美| 精品一区二区免费观看| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产精品国产三级专区第一集| 高清欧美精品videossex| 五月开心婷婷网| 黑人欧美特级aaaaaa片| 久久这里有精品视频免费| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 欧美 日韩 精品 国产| 2022亚洲国产成人精品| 成年人午夜在线观看视频| 99精国产麻豆久久婷婷| av卡一久久| 99re6热这里在线精品视频| 精品久久国产蜜桃| 亚洲av成人精品一区久久| 欧美日韩精品成人综合77777| 99热全是精品| 亚洲精品自拍成人| a级毛片黄视频| 国产精品久久久久久久电影| 午夜91福利影院| 国产成人精品福利久久| 国产成人av激情在线播放 | 亚洲精品乱久久久久久| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 日韩中字成人| 91精品国产九色| 免费高清在线观看视频在线观看| 久久人人爽人人片av| av网站免费在线观看视频| 一本久久精品| av.在线天堂| av国产久精品久网站免费入址| 免费大片黄手机在线观看| 成人影院久久| 久久亚洲国产成人精品v| 黑人猛操日本美女一级片| 男人添女人高潮全过程视频| 亚洲av福利一区| 午夜福利视频在线观看免费| 亚洲伊人久久精品综合| 九九爱精品视频在线观看| 男人操女人黄网站| 超碰97精品在线观看| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 国产精品一区www在线观看| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 久久国产亚洲av麻豆专区| 91精品三级在线观看| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 日韩电影二区| 多毛熟女@视频| 一级毛片aaaaaa免费看小| 亚洲国产欧美在线一区| 亚洲av成人精品一区久久| av免费在线看不卡| 丁香六月天网| av又黄又爽大尺度在线免费看| 91成人精品电影| 搡女人真爽免费视频火全软件| 中文字幕亚洲精品专区| av免费观看日本| 亚洲av综合色区一区| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 免费黄色在线免费观看| freevideosex欧美| 麻豆乱淫一区二区| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 99热6这里只有精品| 成人毛片60女人毛片免费| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 日韩大片免费观看网站| 丝袜喷水一区| 2018国产大陆天天弄谢| 久久这里有精品视频免费| 精品久久久久久久久av| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 免费观看无遮挡的男女| 五月开心婷婷网| 久久精品人人爽人人爽视色| 久久97久久精品| 国产欧美亚洲国产| 91精品国产国语对白视频| 国产在线视频一区二区| 日日摸夜夜添夜夜爱| 大香蕉久久网| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 日日爽夜夜爽网站| 亚洲av二区三区四区| 美女福利国产在线| 久久国产精品大桥未久av| 午夜91福利影院| 99国产综合亚洲精品| 精品久久久精品久久久| 在线天堂最新版资源| 美女cb高潮喷水在线观看| 亚洲第一区二区三区不卡| 丰满少妇做爰视频| 精品熟女少妇av免费看| 美女国产高潮福利片在线看| 亚洲一区二区三区欧美精品| 久久精品夜色国产| 只有这里有精品99| 香蕉精品网在线| 久久精品国产自在天天线| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 日韩中字成人| 极品少妇高潮喷水抽搐| 一本色道久久久久久精品综合| 精品久久蜜臀av无| av一本久久久久| 亚洲不卡免费看| 少妇人妻久久综合中文| 亚洲欧美色中文字幕在线| 七月丁香在线播放| 成人综合一区亚洲| 国产精品三级大全| a级片在线免费高清观看视频| 中文字幕最新亚洲高清| 在线精品无人区一区二区三| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 国产精品一区二区在线观看99| 热re99久久国产66热| 国产高清不卡午夜福利| 国产精品熟女久久久久浪| 91久久精品电影网| 国产乱来视频区| 午夜av观看不卡| 亚洲精品国产av蜜桃| 日韩精品有码人妻一区| 久久久久久久久久久丰满| 99久久中文字幕三级久久日本| 久久久a久久爽久久v久久| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产精品一二三区在线看| 亚洲精品亚洲一区二区| 久久久午夜欧美精品| 国产高清不卡午夜福利| 日本av手机在线免费观看| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 国国产精品蜜臀av免费| 欧美97在线视频| 99久久中文字幕三级久久日本| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 街头女战士在线观看网站| 午夜福利影视在线免费观看| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 日韩欧美一区视频在线观看| 亚洲国产欧美在线一区| 一级爰片在线观看| 国产一区二区在线观看日韩| 少妇人妻精品综合一区二区| 国产成人精品无人区| 一本一本综合久久| videosex国产| 久久精品久久精品一区二区三区| av视频免费观看在线观看| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 精品视频人人做人人爽| 在线精品无人区一区二区三| 一区二区日韩欧美中文字幕 | av免费在线看不卡| 午夜精品国产一区二区电影| 另类亚洲欧美激情| 国产永久视频网站| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 老司机影院毛片| 校园人妻丝袜中文字幕| 久久久欧美国产精品| 国产成人精品婷婷| 老女人水多毛片| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 一边摸一边做爽爽视频免费| 中文天堂在线官网| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 国产高清不卡午夜福利| 久久 成人 亚洲| 全区人妻精品视频| 在线免费观看不下载黄p国产| 亚洲天堂av无毛| 精品人妻一区二区三区麻豆| 欧美国产精品一级二级三级| 久久精品国产亚洲av涩爱| 午夜91福利影院| 亚洲av欧美aⅴ国产| 久久精品久久久久久久性| 亚洲av成人精品一二三区| 丝袜喷水一区| 久久影院123| 九草在线视频观看| 美女cb高潮喷水在线观看| 亚洲精品自拍成人| 成年av动漫网址| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 91久久精品国产一区二区成人| 亚洲第一区二区三区不卡| 一级黄片播放器| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 午夜影院在线不卡| 久久午夜综合久久蜜桃| 欧美最新免费一区二区三区| 熟女人妻精品中文字幕| 少妇被粗大猛烈的视频| 午夜影院在线不卡| 天堂8中文在线网| 波野结衣二区三区在线| 亚洲国产精品成人久久小说| 观看av在线不卡| 精品亚洲成国产av| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 久久久久久久久久久免费av| 国产亚洲精品久久久com| 免费高清在线观看视频在线观看| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 一级片'在线观看视频| 亚洲久久久国产精品| 黄片播放在线免费| 中文字幕人妻丝袜制服| 久久人人爽人人片av| 精品国产一区二区久久| 国产淫语在线视频| 国产av国产精品国产| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 国产视频内射| 色婷婷av一区二区三区视频| 久久久欧美国产精品| 男男h啪啪无遮挡| 满18在线观看网站| 晚上一个人看的免费电影| 国产精品人妻久久久影院| 日韩在线高清观看一区二区三区| 精品国产国语对白av| 伊人亚洲综合成人网| 91精品国产九色| 日韩中文字幕视频在线看片| 色5月婷婷丁香| 久久午夜福利片| 午夜日本视频在线| 亚洲少妇的诱惑av| 男女高潮啪啪啪动态图| 亚洲人成77777在线视频| 最近的中文字幕免费完整| 人人妻人人澡人人看| 99久久精品一区二区三区| 国产成人免费无遮挡视频| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 91精品国产九色| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 尾随美女入室| 国产亚洲精品久久久com| 91aial.com中文字幕在线观看| av在线app专区| 青春草亚洲视频在线观看| 国产精品.久久久| 欧美精品亚洲一区二区| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 七月丁香在线播放| 久久av网站| 春色校园在线视频观看| av在线观看视频网站免费| 精品亚洲成国产av| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 免费观看av网站的网址| 婷婷成人精品国产| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 九草在线视频观看| 国产黄色视频一区二区在线观看| 亚洲国产av新网站| a级片在线免费高清观看视频| 午夜福利影视在线免费观看| 制服诱惑二区| 精品视频人人做人人爽| 嫩草影院入口| av在线观看视频网站免费| 久久久a久久爽久久v久久| 校园人妻丝袜中文字幕| 欧美精品一区二区大全| 中文字幕免费在线视频6| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 久久人人爽人人片av| 色吧在线观看| 伊人久久精品亚洲午夜| 熟女人妻精品中文字幕| 国产成人91sexporn| 国产毛片在线视频| 老司机影院成人| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 99久久精品一区二区三区| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 免费高清在线观看视频在线观看| 亚洲欧美色中文字幕在线| 国产高清有码在线观看视频| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 高清在线视频一区二区三区| 国产综合精华液| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 久久精品国产亚洲av天美| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 国产熟女欧美一区二区| 国产精品久久久久久久久免| 九色成人免费人妻av| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 国产乱来视频区| 大码成人一级视频| 看十八女毛片水多多多| a级毛色黄片| 欧美精品国产亚洲| 色94色欧美一区二区| 日本黄色片子视频| 一边亲一边摸免费视频| 久久久久久久久久人人人人人人| 超碰97精品在线观看| 精品久久国产蜜桃| 欧美最新免费一区二区三区| 青春草国产在线视频| 国产一区亚洲一区在线观看| 亚洲精品美女久久av网站| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 亚洲无线观看免费| 精品卡一卡二卡四卡免费| 欧美精品一区二区免费开放| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产极品天堂在线| 久久久久久久亚洲中文字幕| 亚洲,一卡二卡三卡| 日韩av在线免费看完整版不卡| 久久久国产欧美日韩av| 国产成人免费无遮挡视频| 大香蕉久久成人网| av专区在线播放|