不同劑量α-硫辛酸對卡那霉素所致豚鼠耳聾后聽覺誘發(fā)電位的影響

米彥芳 董明敏

1）鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院耳鼻喉科 鄭州 450014 2）鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳科 鄭州 450052

α-硫辛酸（alpha-lipoic acid，LA）是一種抗氧化劑，可通過清除自由基、螯合金屬離子、再生其他抗氧化劑等途徑發(fā)揮抗氧化作用。其優(yōu)勢在于可以在水、脂兩相狀態(tài)發(fā)揮其抗氧化作用；以及可以通過血-迷路屏障及血-腦屏障［1］。有研究表明，它可以阻止卡那霉素的激活；抑制活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）的形成；清除多余的ROS；增加體內(nèi)其他抗氧化物質(zhì)（如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、丙二醛）的含量及其活性等方式，發(fā)揮其保護(hù)耳蝸內(nèi)、外毛細(xì)胞等組織細(xì)胞的作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 70只白色、紅目豚鼠（選用耳廓反射靈敏；健康；無中耳疾?。?，雌雄不分，體質(zhì)量120～150g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。聽性腦干反應(yīng)（ABR）檢查閾值正常。在實(shí)驗(yàn)期間，自由飲食。按照隨機(jī)抽樣的原則，將試驗(yàn)動(dòng)物分成7組（每組10只，20耳）：Ⅰ組：正常對照組：不施加任何處理因素；Ⅱ組：KM 組：KM 400 mg／（kg·d）。Ⅲ組：LA 組：LA 50 mg／（kg·d）。Ⅳ組：治 療 組1（25 mgLA）：KM 400mg／（kg·d）＋LA 25 mg／（kg·d）。Ⅴ組：治療組2（37.5 mgLA）：KM 400 mg／（kg·d）＋LA 37.5mg／（kg·d）。Ⅵ組：治療組3（50 mgLA）：KM 400 mg／（kg·d）＋LA 50 mg／（kg·d）。Ⅶ組：治療組4（75 mgLA）：KM 400mg／（kg·d）＋LA 75mg／（kg·d）。

1.2 儀器及試劑

1.2.1 主要儀器：Cadwell Quantum 84型誘發(fā)電位系統(tǒng)（美國產(chǎn)），及其配套的Microline-184型打印機(jī)。

1.2.2 主要試劑：KM：購自安徽省皖北藥業(yè)股份有限公司；LA：上海浦東制藥廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 用藥方法：Ⅱ組、Ⅳ～Ⅶ組豚鼠，KM 肌內(nèi)注射400 mg／（kg·d），連用7d。Ⅲ～Ⅶ組豚鼠的LA 腹腔注射。同時(shí)用KM 及LA 時(shí)，兩藥相隔時(shí)間12h。

1.3.2 觀察指標(biāo)及方法：觀察豚鼠的一般行為，記錄；停藥后測ABR。

1.3.3 ABR 測試：麻醉：選用10%水合氯醛（150 mg／kg），腹腔內(nèi)注射。麻醉達(dá)成后，置實(shí)驗(yàn)豚鼠于隔離的電屏蔽室內(nèi)。隔離室內(nèi)，本底噪聲選用30dB HL。測試期內(nèi)，豚鼠肛溫保持在38℃左右。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用t檢驗(yàn)、單因素方差分析，以α＝0.05作為檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 日常狀態(tài) Ⅱ組（KM）和Ⅳ組（25mg LA）的豚鼠在給藥后2d，即可出現(xiàn)以下反應(yīng)：活動(dòng)量下降；飲食量減少。繼續(xù)給KM 及LA，上述反應(yīng)日漸明顯，并出現(xiàn)耳廓下垂、毛蓬松并失去光澤等現(xiàn)象。其余各組豚鼠無明顯異常的表現(xiàn)。

2.2 ABR 結(jié)果 見表1、2。各波的潛伏期、Ⅰ～Ⅲ波間期及閾值：Ⅰ組（正常對照組）、Ⅴ組（37.5 mg／（kg·d）LA 治療組）～Ⅶ（75mg／（kg·d）LA）組之間的各波的潛伏期、Ⅰ～Ⅲ波間期及閾值的差異，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Ⅲ組（LA 組）和Ⅳ組（25mg／（kg·d）LA）的各波的潛伏期、和Ⅰ～Ⅲ波間期稍延長，閾值稍高。雖然Ⅲ組和Ⅳ組之間的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但是，與其他組豚鼠ABR 的差異顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Ⅱ組（KM 組）豚鼠的ABR 各波潛伏期、及Ⅰ～Ⅲ波間期最長，閾值也最高，與其他各組豚鼠ABR 的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 ABR 結(jié)果 （ms）

表2 ABR 閾值結(jié)果 （dB）

3 討論

3.1 卡那霉素耳毒性機(jī)制 實(shí)驗(yàn)可見，KM 組的豚鼠ABR各波的潛伏期以及Ⅰ～Ⅲ波的間期都明顯延長，并伴隨閾值上升。由此可見：400mg／（kg·d）卡那霉素，連用一周，即可損傷到豚鼠耳蝸的組織細(xì)胞，發(fā)揮其耳毒性作用。

雖然，學(xué)術(shù)上關(guān)于氨基糖甙抗生素的耳毒性機(jī)制有許多觀點(diǎn)；但是，伴隨著可直接檢測到使用氨基糖甙類抗生素以后，耳蝸組織內(nèi)可產(chǎn)生出大量的ROS，氨基糖甙類抗生素可以在耳蝸的組織細(xì)胞內(nèi)誘發(fā)ROS的合成已成為定論。隨著大量的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明：在卡那霉素的耳毒性機(jī)制中，ROS增多發(fā)揮著重要作用。1999年Sha［2］等證實(shí)卡那霉素、慶大霉素、鏈霉素、新霉素等氨基糖甙類抗生素均可刺激耳蝸組織細(xì)胞產(chǎn)生ROS，同時(shí)提出可能的機(jī)制：（1）鐵與氨基糖甙類抗生素形成非活性的復(fù)合體：Fe3＋-AmAn；（2）Fe3＋-AmAn還原成Fe2＋-AmAn，后者具有氧化活性；（3）催化O2與一電子形成.O2-；（4）經(jīng)過鏈?zhǔn)椒磻?yīng)形成：如H2O2等自由基。在耳蝸組織細(xì)胞中，每一步還原過程都可以產(chǎn)生“副產(chǎn)品”--ROS。該研究還進(jìn)一步地證實(shí)了ROS與氨基糖甙類抗生素的耳毒性之間的關(guān)系，并提出ROS清除劑可拮抗氨基糖甙類抗生素的耳毒性。

3.2 LA 的抗氧化性 以及抗氨基糖甙類抗生素耳毒性的機(jī)制α-硫辛酸，美國生物化學(xué)醫(yī)學(xué)會(huì)稱其為lipoic acid（LA）［3］，因此，本文以LA 稱之。作為高效的、能量型氧自由基清除劑，LA 的分子量很小（＜150），還是存在于人體內(nèi)的、天然型代謝物質(zhì)。因此，外源性的LA 很容易被機(jī)體的組織細(xì)胞吸收和利用。另外，LA 在機(jī)體組織內(nèi)容易轉(zhuǎn)化，可被還原為二氫硫辛酸（dihydrolipoic acid，DHLA）。所以，LA 在機(jī)體組織內(nèi)是以LA 和DHLA 兩種形式存在的，二者在體內(nèi)互相協(xié)調(diào)、互相補(bǔ)充，有效地清除大部分的氧自由基。LA 可以螯合金屬離子，抑制ROS的產(chǎn)生，及防止脂質(zhì)過氧化的損傷。LA 和DHLA 二者都為雙歧性因子，其溶解性無論在脂相還是水相中均表現(xiàn)良好，其抗氧化作用可以充分發(fā)揮。LA 可通過血-腦屏障和血-迷路屏障，可以在內(nèi)耳迷路中發(fā)揮其抗氧化作用。LA 還可再生其他的抗氧化劑：如激活VitC、VitE、GSH 等，進(jìn)一步對機(jī)體的抗氧化防御系統(tǒng)進(jìn)行修復(fù)；對有關(guān)組織細(xì)胞正常生長和代謝起影響作用的調(diào)節(jié)蛋白進(jìn)行保護(hù)；對HIV 的復(fù)制過程進(jìn)行抑制；抑制性影響轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的激活過程。故而作為“通用型抗氧化劑”得到共識(shí)［4-5］。大量資料對于LA 的抗氧化效果進(jìn)行了肯定。

本研究顯示：Ⅴ組～Ⅶ組的豚鼠，一般情況和ABR 結(jié)果等觀察項(xiàng)目，與Ⅰ組相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與Ⅱ組相比，Ⅳ組中豚鼠的各項(xiàng)觀察指標(biāo)提示明顯改善。由此分析：LA 對卡那霉素致耳毒性作用起拮抗效應(yīng)，可以對豚鼠的耳蝸組織細(xì)胞起保護(hù)作用。與Conlon［6］等采用LA 對氨基糖甙類抗生素耳毒性進(jìn)行拮抗研究的觀察結(jié)果。

氨基糖甙類抗生素在進(jìn)入機(jī)體后，特別是在內(nèi)淋巴內(nèi)由Fe進(jìn)行激活，可增加耳蝸組織細(xì)胞內(nèi)的ROS，從而對耳蝸的抗氧化防御系統(tǒng)進(jìn)行破壞，造成LPO 損害。由此提示LA 對卡那霉素致耳毒性的拮抗機(jī)理有可能是：（1）LA 螯和金屬Fe，防止激活卡那霉素，抑制生成ROS。（2）增加抗氧化劑（包括SOD、GSH、維生素等）的活性和含量，保護(hù)耳蝸組織的抗氧化防御系統(tǒng)，同時(shí)，清除多余的ROS，抑制LPO、對耳蝸組織起保護(hù)作用。（3）對于調(diào)節(jié)蛋白（起維持組織細(xì)胞生長及代謝作用）起保護(hù)作用。最值得關(guān)注的是：LA 可進(jìn)入迷路組織，發(fā)揮抗氧化作用。因此，LA 可以用于防治氨基糖甙類抗生素的耳毒性。本實(shí)驗(yàn)，在進(jìn)一步證實(shí)ROS在卡那霉素耳毒性機(jī)制中，發(fā)揮重要作用的同時(shí)高度評價(jià)了LA 抗氨基糖甙類抗生素耳毒性的臨床治療價(jià)值。

在本研究中對Ⅲ組豚鼠的各項(xiàng)指標(biāo)觀察結(jié)果顯示：即使單純應(yīng)用大劑量LA，也可以產(chǎn)生耳毒性效應(yīng)。此項(xiàng)結(jié)果與Conlon［6］的觀察并不一致。檢索既往的文獻(xiàn)報(bào)告，相關(guān)的實(shí)驗(yàn)及臨床研究中未見類似報(bào)道。亦有其他研究報(bào)道，在生理?xiàng)l件下，外源性LA 可以對機(jī)體內(nèi)的氧化反應(yīng)起抑制作用，從而起到超抗氧化效應(yīng)［7］?？墒?，對正常機(jī)體組織而言，超抗氧化作用究竟是利是弊，與相關(guān)的生物體系有關(guān)，對此仍需進(jìn)一步審重評估。在既往的實(shí)驗(yàn)中，該藥一貫表現(xiàn)出較好的耐受性，在針對人體的臨床研究中，亦未見顯著不良反應(yīng)和毒性表現(xiàn)。故而，LA 的耳毒性可能與超抗氧化作用有關(guān)，也可能是制劑純度不夠，甚或有其他原因存在，目前尚無清晰認(rèn)識(shí)。本研究尚不可以由此推論，LA 的大劑量應(yīng)用會(huì)導(dǎo)致豚鼠的聽力出現(xiàn)下降，仍需要深入的實(shí)驗(yàn)研究。

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