促紅細胞生成素對體外帕金森病模型細胞凋亡及Bax蛋白表達的影響

盧 欣

鄭州大學基礎醫(yī)學院 鄭州 450052

目前的藥物治療能夠改善帕金森病（Parkinson’s Disease，PD）患者的部分癥狀，但不能改變疾病最終結局，目前仍缺乏有效的治療藥物和預防措施。近年研究發(fā)現(xiàn)促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）是一種細胞保護劑，其保護作用在多種中樞神經系統(tǒng)疾病模型中得到證實［1-2］。本試驗通過觀察EPO 對體外PD 模型細胞凋亡和Bax蛋白表達的影響，探討促紅細胞生成素對PD 細胞的保護作用，為臨床治療PD 提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗用SD 乳鼠（＜24h）由鄭州大學實驗動物中心購得，試劑6-OHDA、DMEM 高糖培養(yǎng)基和特級胎牛血清購自美國Sigma公司，兔抗鼠TH 試劑盒和Bax免疫組化試劑盒購自武漢Boster公司，TUNEL 細胞凋亡原位檢測試劑盒（比色法）購自北京中昊生物公司，EPO 購自沈陽三生制藥有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組：將12只乳鼠用75%酒精消毒，在超凈臺內斷頭取出中腦腹側部，剔除干凈腦膜和血管，用預冷的PBS洗滌3遍，加入0.25%胰酶12mL 在37℃水浴消化20min，加入含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)液終止消化1min，2 000目濾網過濾。按2×105／mL 和1×105／mL加入6孔板和96孔板中，37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，隔日換液。培養(yǎng)至第7天加入EPO（10U），12h后加入6-OHDA（100μmol／L），分為對照組，6-OHDA 組和EPO＋6-OHDA 組。

1.2.2 TH 免疫組化鑒定多巴胺能神經元：處理后的細胞按TH 試劑盒說明操作進行，細胞膜或胞漿內出現(xiàn)棕黃色產物的細胞為TH 陽性細胞即多巴胺能神經元。

1.2.3 TUNEL 法 細 胞 原 位 凋 亡 檢 測：凋 亡 細 胞 采 用TUNEL法檢測，具體操作步驟按試劑盒說明書進行。

1.2.4 Bax免疫組化染色：用SABC 法，具體操作步驟按試劑盒說明書進行。

1.2.5 結果觀察：在顯微鏡下觀察TH 陽性細胞、TUNEL陽性細胞和Bax免疫陽性細胞的表達情況，用媒體真彩色病理圖文分析系統(tǒng)對圖像進行分析。

1.3 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)用SPSS 13.0進行統(tǒng)計學處理，采用t檢驗和方差分析，結果均以（±s）表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TH 陽性細胞 TH 陽性細胞為棕黃色的多巴胺能神經元細胞。6-OHDA 組TH 陽性細胞明顯減少，神經元突起變短消失；EPO＋6-OHDA 組神經突起較長且較多，相互交織在一起。

2.2 TUNEL法凋亡細胞檢測 TUNEL 染色陽性的凋亡神經元呈三角形或扇形，固縮深染，體積縮小，胞核呈棕黃色，非凋亡細胞則為藍色。6-OHDA 組存在明顯的神經元細胞凋亡（P＜0.05），EPO＋6-OHDA 組神經元凋亡細胞明顯減少（P＜0.05）。見表1。

2.3 Bax蛋白表達 Bax蛋白表達部位在神經元細胞的胞質，Bax陽性神經元形狀不規(guī)則，胞內沉積有棕黃色物質。6-0HDA 組Bax蛋白表達較高（P＜0.05），EPO＋6-OHDA 組Bax蛋白表達減少（P＜0.05）。數(shù)據(jù)見表1。

表1 促紅細胞生成素對多巴胺能神經元的保護作用（±s，n＝6）

表1 促紅細胞生成素對多巴胺能神經元的保護作用（±s，n＝6）

與對照組比，＊P＜0.05；與6-OHDA 組比，△P＜0.05

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3 討論

帕金森病（Parkinson＇s disease，PD）是一種以靜止性震顫、肌肉僵直、運動弛緩和姿勢步態(tài)異常等癥狀為主要臨床表現(xiàn)的中樞神經退行性疾病。其主要病理特征為中腦黑質多巴胺能神經元的變性死亡。到目前為止，PD 的發(fā)病機制仍不完全清楚。研究表明6-OHDA 可在體外誘導多巴胺能神經元細胞的凋亡［3-4］。該實驗用6-OHDA 干預制作體外帕金森病模型，TH 免疫組化方法鑒定多巴胺能神經元，TUNEL法檢測PD 模型細胞凋亡和測定Bax表達。

促紅細胞生成素（EPO）是一種有效的神經細胞保護劑，在多種神經系統(tǒng)的疾病模型中已經得到證實［1］。EPO 受體在一定條件下能夠在多巴胺能神經細胞表面表達，說明EPO對其可能有保護作用［5］。在MPTP 誘導的PD 模型中，EPO可以使神經元凋亡率下降［6］。Tatton等和Adams等的研究證實PD 患者黑質神經元Bax表達增強，細胞凋亡增加［7-8］。Kumral等的研究證實EPO 可以降低促凋亡蛋白Bax的表達［9］保護神經元細胞。其可能的機制是減少線粒體內活性氧的產生，導致細胞色素C 產生減少，使Caspase活性減弱，從而抑制了細胞凋亡［10-11］。Yan等［12］實驗也表明EPO 對PC12細胞的PD 模型有明顯的保護作用，Bax蛋白表達減少凋亡細胞減少。本實驗在制作PD 模型前預先加入EPO 保護，測定凋亡細胞和Bax蛋白，發(fā)現(xiàn)與對照組比較，6-OHDA組細胞凋亡有顯著性差別（P＜0.05），同時Bax蛋白表達明顯增高（P＜0.05）。而預先加入EPO 后情況明顯不同，EPO＋6-OHDA 組與6-OHDA 組比較，凋亡細胞數(shù)目和Bax蛋白表達均明顯減少（P＜0.05），說明EPO 對PD 的神經元細胞有保護作用，使Bax蛋白表達下降細胞凋亡減少。

EPO 能一定程度上抑制細胞凋亡減少Bax蛋白表達，從而保護多巴胺能神經元細胞，因此EPO 可以作為神經保護劑，為臨床治療和預防PD 提供新的理論依據(jù)。

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