維甲酸在內(nèi)耳發(fā)育中的作用及其機制

管 明 徐婭蘋

感音神經(jīng)性耳聾患者在臨床上多見，約占總?cè)丝诘?0%。主要是因為衰老、噪聲、耳毒性藥物、外傷、感染、腫瘤、遺傳、免疫等體內(nèi)外因素所致，且哺乳動物耳蝸毛細(xì)胞破壞后再生能力有限，常引起不可逆性的聽力下降，治療困難。隨著內(nèi)耳發(fā)育機制研究的深入和干細(xì)胞組織工程技術(shù)的逐漸成熟，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)許多因子，如EGF、FGF、TGF－α、甲狀腺素等在內(nèi)耳毛細(xì)胞、支持細(xì)胞的分化、成熟、再生中起作用，試圖通過加入這些活性因子促進(jìn)毛細(xì)胞再生，或誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為毛細(xì)胞來治療感音神經(jīng)性耳聾。維甲酸(RA)作為維生素A的活性衍生物，在許多器官的發(fā)育中必不可少。同樣，RA在胚胎期內(nèi)耳發(fā)育和出生后內(nèi)耳功能維持中起關(guān)鍵作用。本文就維甲酸合成酶、維甲酸分解酶，維甲酸受體在內(nèi)耳中的特異性表達(dá)及維甲酸在內(nèi)耳發(fā)育中的作用及其機制做綜述。

一、維甲酸的代謝及維甲酸合成酶和分解酶在內(nèi)耳的分布

1．維甲酸的代謝:在細(xì)胞內(nèi)，維生素A與維生素A結(jié)合蛋白(CRBP)緊密結(jié)合后，首先，在酒精脫氫酶家族(ADH家族)的作用下，維生素A氧化成視黃醛;接著，視黃醛在視黃醛脫氫酶(RALDHs，又稱RA合成酶，包括 RALDH1、RALDH2、RALDH3、RALDH4)的作用下，視黃醛氧化成全反式維甲酸(ATRA)和9－cis維甲酸(9－cisRA)［1］。而在細(xì)胞色素 P450超家族成員CYP26(又稱RA分解酶:包括CYP26A1、CYP26B1、CYP26C1)的作用下，RA被代謝分解。RA在內(nèi)耳的特定時間、特定部位的表達(dá)是通過RALDHs和CYP26來調(diào)控的，所以了解RALDHs和CYP26在內(nèi)耳的表達(dá)有助于我們理解RA在內(nèi)耳發(fā)育過程中的作用。

2．RA合成酶在內(nèi)耳的表達(dá):RALDH1、RALDH2、RALDH3存在于胚胎第9．5～10天(E9．5～10)的聽泡中。在 E10．5，RALDH1、2、3表達(dá)局限于聽泡上皮。其中RALDH1表達(dá)范圍最廣，表達(dá)在內(nèi)淋巴管原基和聽泡上皮腹外側(cè);RALDH2僅表達(dá)于聽泡上皮側(cè)面;RALDH3表達(dá)于聽泡上皮腹側(cè)和中間區(qū)。在所有 RALDH中，RALDH2在此期表達(dá)量最高。在E12.5，RALDH1、2、3 存在于將發(fā)育為前庭、耳蝸上皮的聽泡上皮區(qū)，另外RALDH1、2還存在于內(nèi)淋巴管上皮中。在E14．5，RALDH1存在于半規(guī)管上皮、內(nèi)淋巴管、壺腹嵴;RALDH2存在于前庭鄰近壺腹嵴的上皮區(qū)及耳蝸非感覺上皮區(qū)。在E18．5，RALDH1局限于前庭球囊、橢圓囊和嵴的一些區(qū)域及耳蝸柯替氏器。RALDH2局限于耳蝸血管紋、前庭膜及前庭鄰近壺腹嵴的上皮區(qū)。而在 E14．5、E18．5，RALDH3 均表達(dá)于半規(guī)管、壺腹嵴、球囊、橢圓囊的感覺上皮區(qū)及耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)［2］。

3．RA 分解酶在內(nèi)耳的表達(dá):在 E9．5，CYP26A1已存在于聽泡上皮側(cè)面和腹側(cè)，及其周圍間質(zhì)。在E10．5，CYP26A1局限于聽泡上皮的腹側(cè)，但在周圍間質(zhì)腹側(cè)、中間區(qū)、側(cè)面表達(dá)豐富;CYP26B1表達(dá)局限于聽泡上皮側(cè)面和中間區(qū);CYP26C1存在于聽泡上皮腹側(cè)和間質(zhì)區(qū)。在E12．5，CYP26A1表達(dá)在聽泡上皮腹側(cè)、側(cè)面，及圍繞后半規(guī)管的間質(zhì)區(qū);CYP26B1表達(dá)在聽泡間質(zhì)的腹側(cè)及圍繞水平半規(guī)管的間質(zhì)區(qū)，并存在于將發(fā)育為前庭、耳蝸感覺上皮的聽泡上皮區(qū)。隨著胚胎發(fā)育，CYP26A1表達(dá)下降，在E14．5局限于耳蝸和球囊，在E18．5未發(fā)現(xiàn)有表達(dá)。相反，CYP26B1在 E14．5、E18．5 的耳蝸、前庭感覺上皮有高水平表達(dá)，在出生后開始下降。CYP26C1在E10．5～E12．5的聽泡上皮腹側(cè)和鄰近間質(zhì)表達(dá)［3］。

如上所述，在胚胎發(fā)育的不同時期，RA合成酶(RALDHs)和RA分解酶(CYP26)在內(nèi)耳的表達(dá)部位不同，從而協(xié)調(diào)RA在內(nèi)耳的表達(dá)，這是內(nèi)耳發(fā)育所必須的。Frenz等［4］研究發(fā)現(xiàn)RA過量和不足都將導(dǎo)致內(nèi)耳發(fā)育的畸形。

二、維甲酸受體在內(nèi)耳的分布

維甲酸是通過結(jié)合于細(xì)胞核內(nèi)特異性受體，調(diào)節(jié)目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮作用的，維甲酸受體(retinoic acid receptors)的變異和缺失將引起內(nèi)耳發(fā)育畸形。維甲酸受體屬于細(xì)胞核受體中類固醇/甲狀腺素激素超家族成員，分為兩類:RARs和RXRs。RARs能被全反式維甲酸和9－cis維甲酸激活，而RXRs僅能被9－cis維甲酸激活。RARs可分為:RARα、RARβ、RARγ;而 RXRs包含 RXRα、RXRβ、RXRγ。每一種RARs又能和任何一種RXRs在體內(nèi)外形成異二聚體。結(jié)合了維甲酸的RARs、RXRs、RARs/RXRs異二聚體通過RA反應(yīng)元件(RAREs)作用于許多目標(biāo)基因，轉(zhuǎn)錄功能蛋白，發(fā)揮生物活性作用。RA受體在轉(zhuǎn)導(dǎo)RA信號上是必須的，了解RA受體在內(nèi)耳的表達(dá)有助于我們了解RA在內(nèi)耳發(fā)育中的作用。

在 E10．5，RARβ、RARγ 主要位于將發(fā)育成內(nèi)淋巴管的聽泡上皮周圍間質(zhì)細(xì)胞上。在E12．5，RARα位于聽泡上皮大部分區(qū)域和鄰近間質(zhì)區(qū)域;RARβ主要位于聽泡上皮中間區(qū)和鄰近的間質(zhì)上;RARγ局限表達(dá)在聽泡周圍間質(zhì)上;RXRα在除了將發(fā)育為內(nèi)淋巴管的聽泡上皮沒有表達(dá)外，在聽泡上皮和周圍間質(zhì)廣泛表達(dá);RXRβ在聽泡上皮廣泛表達(dá)，還表達(dá)在周圍間質(zhì)側(cè)面和中間區(qū)，但在腹側(cè)沒有表達(dá);RXRγ局限于聽泡上皮的特殊區(qū)域。在 E18．5，RARα、RARγ、RXRα、RXRβ 分布在耳蝸幾個區(qū)域，相反RARβ、RXRγ局限于蝸軸和基膜。

如上所述，維甲酸受體在胚胎內(nèi)耳的表達(dá)部位是特殊的，同樣在胚胎內(nèi)耳的發(fā)育中起著不同的作用。Romand等［2］提出聽泡中央部位的感覺上皮RA信號的傳導(dǎo)主要依靠RARα和3種RXR，其最終發(fā)育形成耳蝸和球囊，而RARγ和RXRα主要在軟骨性耳囊(otic capsule)成形過程中起轉(zhuǎn)導(dǎo)信號的作用。

三、維甲酸在軟骨性耳囊發(fā)育中的作用

1977年，Lim首次提出RA在軟骨性耳囊中的作用，接著RA在軟骨性耳囊發(fā)育中的作用和作用途徑得到了進(jìn)一步的闡述。1996年，F(xiàn)renz報道在胚胎發(fā)育的特殊時期，暴露于過多的外界ATRA下會使軟骨性耳囊畸形發(fā)育。1998年，Underhill和Weston闡述RARS基因不適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)將抑制軟骨性耳囊發(fā)育。2002年，Romand等［2］更加詳細(xì)的闡述了RA在軟骨性耳囊發(fā)育中的作用，并發(fā)現(xiàn)RARα和RARγ是RA調(diào)節(jié)內(nèi)耳軟骨性耳囊發(fā)育的受體。因為 RARα、RARβ、RARγ 基因單獨缺失突變和 RARα/RARβ、RARβ/RARγ基因無效突變，并不產(chǎn)生內(nèi)耳畸變，但RARα/RARγ基因無效突變，將產(chǎn)生嚴(yán)重的內(nèi)耳畸變。主要表現(xiàn)在:①到胚胎第10．5天，聽泡的大小只有正常的一半;②內(nèi)淋巴管缺失;③到E14，半規(guī)管發(fā)育停止。

RA在軟骨性耳囊發(fā)育中的作用途徑:軟骨性耳囊發(fā)育的早期，兩條信號起了重要作用。①聽泡上皮與周圍間質(zhì)之間的相互作用。La Mantia等［5］闡述在聽泡發(fā)育的早期，間質(zhì)和上皮之間的相互作用包含多條途徑，而RA是上皮和間質(zhì)之間相互作用的途徑之一;②菱腦神經(jīng)組織與聽泡外胚層之間的作用。Mc－caffery等［6］報道菱腦神經(jīng)組織和聽泡外胚層之間的相互作用包含多種因子，而RA是其中的一種。如上所述，RA在軟骨性耳囊發(fā)育的兩條途徑中都發(fā)揮了重要作用。

四、維甲酸在耳蝸毛細(xì)胞分化成熟中的作用

1．維甲酸在毛細(xì)胞分化和再生中的作用:①在生理條件下，RA存在于成年哺乳動物前庭上皮、鳥類前庭上皮和耳蝸血管紋上，而在成年哺乳動物耳蝸上沒有發(fā)現(xiàn)RA的存在;相應(yīng)的，成年哺乳動物前庭上皮和成年鳥類所有上皮均能再生，而成年哺乳動物耳蝸感覺上皮在無外加誘導(dǎo)條件的作用下不能再生，說明RA可能在內(nèi)耳感覺上皮的發(fā)育中起作用;②在體外培養(yǎng)條件下，外源性RA的加入能促進(jìn)毛細(xì)胞分化和再生。例如將小鳥聽泡體外培養(yǎng)，加入RA后，引起毛細(xì)胞分化的提早和毛細(xì)胞數(shù)量的增加;新生大鼠耳蝸柯替氏器體外培養(yǎng)中，加入新霉素破壞耳蝸毛細(xì)胞，再加入RA后，可誘導(dǎo)毛細(xì)胞再生。

2．維甲酸促進(jìn)毛細(xì)胞分化和再生的作用途徑:在Raz的實驗中，RA加入到胚胎柯替氏器培養(yǎng)體系中，誘導(dǎo)產(chǎn)生額外數(shù)量的毛細(xì)胞和支持細(xì)胞，這些額外數(shù)量的毛細(xì)胞和支持細(xì)胞并不是通過促使原有毛細(xì)胞和支持細(xì)胞有絲分裂產(chǎn)生的，所以RA的作用不是促進(jìn)細(xì)胞的有絲分裂［7］。Raz認(rèn)為RA的作用在于誘導(dǎo)內(nèi)耳干細(xì)胞分化為內(nèi)耳感覺前體細(xì)胞，然后內(nèi)耳感覺前體細(xì)胞在細(xì)胞與細(xì)胞相互作用機制下發(fā)育成毛細(xì)胞或支持細(xì)胞。

五、維甲酸在內(nèi)耳發(fā)育中所涉及的相關(guān)因子

1．HOXa－1基因:RARβ/RARγ基因無效突變引起的發(fā)育不全類似于HOXa－1基因缺失，將致大部分耳蝸結(jié)構(gòu)如聽覺毛細(xì)胞、螺旋神經(jīng)元均缺失。而且HOXa－1啟動子上擁有維甲酸反應(yīng)元件(RAREs)，RA調(diào)節(jié)HOXa－1RNA的轉(zhuǎn)錄。所以HOXa－1基因接受RA的調(diào)節(jié)，對內(nèi)耳的發(fā)育起作用。

2．FGF3基因:由中胚層和聽泡鄰近的神經(jīng)組織分泌的FGF3是聽泡發(fā)育的主要誘導(dǎo)因子，而RA和FGF3之間關(guān)系密切:①在Phillips體外培養(yǎng)實驗中，RA誘導(dǎo)形成異位或額外數(shù)量聽泡的作用，是通過誘導(dǎo)FGF3表達(dá)增加實現(xiàn)的，且拮抗FGF3即阻斷外源性RA的作用，不形成異位或額外數(shù)量聽泡;②在小鼠，RALDH2無效突變將引起FGF3表達(dá)下降和表達(dá)失控;③Wendling的實驗發(fā)現(xiàn) RARα/RARβ、RARα/RARγ無效突變的小鼠胚胎和維生素A缺乏的大鼠胚胎中，F(xiàn)GF3異位表達(dá)，并出現(xiàn)額外的小聽泡;④Liu的研究結(jié)果顯示，過量的RA將破壞FGF3信號通路，致內(nèi)耳發(fā)育畸形［8～11］。所有這些實驗都證實了FGF3在RA誘導(dǎo)聽泡發(fā)育過程中起作用。

3．BMP基因:BMP基因是TGF超家族成員，至今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)14類BMP基因。BMP4在聽泡上皮和臨近周圍間質(zhì)中表達(dá)，是聽泡軟骨發(fā)育和毛細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)因子。BMP4基因擁有RA反應(yīng)元件，接受RA的直接調(diào)節(jié)，而且RA的作用是抑制聽泡BMP4表達(dá)的。

4．Shh基因:Shh無效突變，產(chǎn)生內(nèi)耳，尤其是耳蝸畸變，類似于RARα/RARγ無效突變引起的內(nèi)耳畸形。而且Shh基因啟動子上有RA反應(yīng)元件，所以Shh基因接受RA的調(diào)節(jié)，對內(nèi)耳的發(fā)育起作用。

5．TGF－β基因:TGF超家族成員之一，包括TGF－β1和TGF－β2。TGF－β在聽泡上皮上表達(dá);Butts的研究發(fā)現(xiàn):在體外培養(yǎng)中，加入致畸水平的RA，將使TGF－β表達(dá)下降，從而抑制軟骨發(fā)育，影響感覺上皮分化。

6．OTX1和OTX2基因:OTX1和OTX2是RA可能的下游作用因子。在聽泡中表達(dá)，對半規(guī)管和耳蝸的形成起作用。在鼠胚胎期內(nèi)耳中，OTX2的表達(dá)對RA的濃度高度敏感。

7．其他:McCaffery等［6］報道一些生長因子同樣受RA調(diào)節(jié)，包括NT－3、BDNF。它們在聽泡中表達(dá)，是位聽神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元存活所必需的。

綜上所述，維甲酸合成酶、維甲酸分解酶、維甲酸受體、維甲酸在內(nèi)耳有著特異性協(xié)調(diào)表達(dá)，維甲酸在內(nèi)耳聽泡軟骨和內(nèi)耳感覺上皮細(xì)胞分化中起作用，是聽泡形成和內(nèi)耳感覺上皮細(xì)胞分化的重要條件之一。盡管我們例舉了在內(nèi)耳發(fā)育中與維甲酸有關(guān)的許多因子，但是究竟是哪些因子在其中起著最為重要的作用，以及他們相互之間關(guān)系還有待進(jìn)一步闡明。

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