海南毛薯干粉中總還原糖含量的測定

何 嬌， 黃廣民

(海南大學食品學院，海南海口 570228)

海南毛薯干粉中總還原糖含量的測定

何 嬌， 黃廣民

(海南大學食品學院，海南?？?570228)

以葡萄糖為標準溶液，以3，5-二硝基水楊酸為顯色劑，用分光光度法測定海南毛薯干粉中總還原糖含量．結(jié)果表明:在波長480 nm處有最大吸收峰，測定回收率最大為101.9%，最小為99.7%，相對誤差為±1.9%．實測得毛薯干粉中總還原糖含量為71.08%，毛薯中淀粉含量為63.97%．

海南毛薯;還原糖;分光光度法

毛薯(Dioscorea esculenta(Lour．)brukill)又名甜薯、蒂薯、蔓眉(黎語)等，為薯蕷科薯蕷屬藤本植物．海南毛薯有甜薯和蒂薯兩個品種，有人工種植，也有野生品種．蒂薯屬革質(zhì)攀援藤本，蔓長130～150 cm，蔓細而硬，每節(jié)生刺，葉片厚，綠色，呈心臟形，結(jié)薯集中且多露于土壤表面，每株結(jié)薯約10～12個，最多可高達二十多個．蒂薯薯塊呈橢圓形或長圓形，根毛少而短，表皮赤褐色，薯肉白色細軟，帶黏性，富含淀粉，味稍淡且甜，煮熟后不易脫皮．甜薯屬攀繞藤本，莖蔓青紫色，蔓長100～130 cm，結(jié)薯比蒂薯少，每株結(jié)薯約8～10個，最多可結(jié)薯十多個．甜薯結(jié)薯較深，薯塊大，呈長圓形，表皮赤褐色，根毛多而長，薯皮革質(zhì)，肉質(zhì)細軟，富含淀粉，含糖分高，煮熟后易脫皮，味甜可口．

海南毛薯適應性廣，各種旱地土壤均可種植，但火山灰土壤種植，淀粉含量最高．每年2～3月播種，9～10月收獲，不需要特別進行田間管理，畝產(chǎn)鮮薯可達1 000～2 500 kg，適當?shù)奶镩g管理，產(chǎn)量可突破3 000 kg．毛薯是海南特產(chǎn)的農(nóng)家雜糧，男女老少，一年四季，均可食用．具有健脾止瀉，益肺滋腎，解毒斂瘡的功效［1］．

海南省獨特的自然條件非常適宜于海南毛薯的生長，毛薯已成為海南省的一大特產(chǎn)．據(jù)統(tǒng)計，全省每年種植面積約1.8×107m2以上．海南出產(chǎn)的毛薯，產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)、口感好，深受島上居民喜愛．海南毛薯富含淀粉，是制備酒精的理想原料．還原糖和淀粉含量是毛薯制備酒精的關(guān)鍵性指標，毛薯中總還原糖含量乘以0.9便是其淀粉含量．毛薯干粉中總還原糖測定尚未見文獻報道，因此，本研究開展了這方面的工作．

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

海南毛薯(以下簡稱毛薯)干粉制備:新采收的毛薯，去毛、洗凈、切片、烘干，粉碎至80～100目，得含水量為8% ～12%干粉，備用．

1.1.2 試劑

鹽酸、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、苯酚、亞硫酸氫鈉、3，5-二硝基水楊酸、葡萄糖等，所有試劑均為分析純．

1.2 儀器與設備

721-型分光光度計，上海精密科學儀器有限公司;齒爪式粉碎機、不銹鋼水解反應釜等．

1.3 標準溶液的配制

1.3.1 葡萄糖標準溶液的配制

準確稱取預先于105℃烘箱中干燥至恒重的葡萄糖0.100 0 g，用少量蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶，加蒸餾水稀釋定容，得質(zhì)量濃度為1 mg/mL葡萄糖標準溶液［2］．

1.3.2 DNS顯色劑的制備

甲液:稱取6.9 g重蒸餾的苯酚溶解于15.2 mL 10%氫氧化鈉溶液中，稀釋至69 mL，加入6.8 g亞硫酸氫鈉，搖勻．

乙液:稱取225 g酒石酸鉀鈉于1 000 mL燒杯中，加入300 mL 10% 氫氧化鈉溶液，攪拌溶解，加入880 mL 1%3，5-二硝基水楊酸(DNS)溶液，激烈搖勻．

將甲液與乙液充分混合，貯于棕色瓶中，室溫下于陰涼處放置一周，備用［3］．

1.4 實驗原理

在中性或偏堿性條件下，3，5-二硝基水楊酸與葡萄糖共熱被還原生成棕色氨基化合物，其反應式如下:

在一定范圍內(nèi)，葡萄糖的質(zhì)量濃度與溶液的吸光度成正比，利用分光光度法可測定毛薯干粉中總還原糖的含量［4］．

1.4 高壓氧治療［2］ 治療組所有患者在引流管拔除24 h后開始行高壓氧治療。采用空氣加壓多人艙，治療壓力2 ATA，加減壓時間各20 min，穩(wěn)壓65 min、中間停止吸氧（休息）5 min，每天1次，10次為一個療程，治療2～3個療程。

1.5 樣品處理

準確稱取5.000 0 g毛薯干粉于三頸燒瓶中，按一定料液比加入一定濃度的稀鹽酸，調(diào)成粉漿．裝上回流冷凝管，在一定溫度下，水解一定時間，水解液用氫氧化鈉溶液中和，轉(zhuǎn)入250 mL容量瓶，用蒸餾水稀釋定容，搖勻，備用．

1.6 DNS的比色測定

準確吸取5.0 mL毛薯水解稀釋液于100 mL容量瓶，加蒸餾水稀釋定容，搖勻．分別準確吸取1.0 mL水解稀釋液于50 mL容量瓶，加入1.5 mL DNS溶液、2.0 mL蒸餾水，于沸水浴中加熱5 min，顯色，迅速冷卻，用蒸餾水稀釋定容，搖勻．另取50 mL容量瓶，加入1.5 mL DNS顯色劑、2.0 mL蒸餾水，方法與上述相同，加蒸餾水稀釋定容作空白液．選用1 cm比色皿，選擇適當?shù)奈詹ㄩL，分別測定其吸光度，按式(1)計算水解液中總還原糖含量［5］．

式(1)中，A為水解液的吸光度;W為毛薯質(zhì)量，g;M為工作曲線的斜率．

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長的選擇

準確吸取1.0 mg/mL葡萄糖標準溶液1.0 mL于50 mL容量瓶中，按 1.6中方法［6］，配成 0.020 mg/mL標準葡萄糖溶液，選擇不同的吸收波長，選擇1 cm的比色皿，分別測定其吸光度(并以1.5，2.0 mg/mL葡萄糖標準溶液作對照)，結(jié)果見圖1．

圖1 波長與吸光度的關(guān)系Fig．1 Relationship between wavelength and absorbance

從圖1可以看出，質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的葡萄糖標準溶液在480 nm處有最大吸收峰，而作為對照組的質(zhì)量濃度為1.5，2.0 mg/mL葡萄糖標準溶液的最大吸收波長也在480 nm處，故選擇較佳測定波長為480 nm．

2.2 標準工作曲線的繪制

準確吸取1.0 mg/mL葡萄糖標準溶液于50 mL容量瓶，按1.6中方法，分別配成質(zhì)量濃度分別為0，0.002，0.004，0.006，0.008，0.010，0.012，0.014，0.016，0.018，0.020，0.022，0.024，0.026，0.028，0.030，0.032，0.034，0.036，0.038，0.040 mg/mL 的葡萄糖標準溶液．選擇1 cm比色皿，在480 nm處測定吸光度．以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，結(jié)果見圖2．

圖2 葡萄糖含量測定標準曲線Fig．2 Standard curve for glucose determination

從圖2可以看出，隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的增大，吸光度呈線性上升．作一元回歸分析，得到吸光度對葡萄糖質(zhì)量濃度的回歸方程為:Y=22.57X－0.010 9(R2=0.996 1)．

2.3 正交試驗設計

表1 正交試驗因素水平表Tab．1 Factors and levels in L9(34)orthogonal test

準確稱取5.0000 g毛薯干粉，按L9(34)正交表的料液比，加入一定量的鹽酸溶液，調(diào)成粉漿．在一定溫度下，水解一定時間，水解液用氫氧化鈉溶液中和，轉(zhuǎn)入250 mL容量瓶，加蒸餾水稀釋定容．準確吸取5.00 mL水解稀釋液于100 mL容量瓶，加蒸餾水稀釋定容，搖勻．準確吸取1.0 mL水解稀釋液于50 mL容量瓶，按1.6中方法，選擇1 cm比色皿，于480 nm處測定其吸光度，其試驗結(jié)果與極差分析情況見表2．

表2 L9(34)正交試驗結(jié)果與極差分析Tab．2 Analysis of variance and results of L9(34)orthogonal test

由表2極差R分析可知，影響毛薯粉漿水解的因素主次順序:料液比＞水解溫度＞水解時間＞鹽酸濃度．毛薯粉漿料液比是主要的影響因素，其次是水解溫度、水解時間，影響最小的是鹽酸濃度，優(yōu)化的反應組合是A3B2C1D3，即當鹽酸濃度1.0 mol/L，水解時間2.0 h，料液比(g/mL)1∶12，水解溫度125℃時，毛薯粉漿水解液的吸光度最高，達到0.227．然而，正交試驗確定的優(yōu)化條件，不一定是全部實驗中最佳的條件．因正交試驗設計時，每個試驗參數(shù)都是隨機的，其因素水平不同，所得的結(jié)果也不一樣．因此，本文又進一步做單因素實驗，單獨考察各主要因素對毛薯粉漿水解的影響［9－10］．

2.4 鹽酸濃度對毛薯粉漿水解的影響

準確稱取5.000 0 g毛薯干粉于三頸燒瓶中，分別按1∶16 料液比(g/mL)加入0.025，0.050，0.075，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50，0.60，0.70，0.80，0.90，1.00 mol/L的鹽酸溶液，調(diào)成粉漿．裝上回流冷凝管，水解溫度103℃，水解時間2.0 h，水解液用氫氧化鈉溶液中和，轉(zhuǎn)入250 mL容量瓶，加蒸餾水稀釋定容．準確吸取5.0 mL水解稀釋液于100 mL容量瓶，加蒸餾水稀釋定容，搖勻．準確吸取1.0 mL水解稀釋液于50 mL容量瓶，按1.6中方法，選擇1 cm比色皿，于480 nm處測定其吸光度，結(jié)果見圖3．

圖3 鹽酸濃度對毛薯粉漿水解的影響Fig．3 Effects of hydrochloric acid concentration on hydrolysis of dry powder of Dioscorea esculenta(Lour．)brukill

從圖3可以看出，鹽酸濃度小于0.30 mol/L時，隨著鹽酸濃度的增大，毛薯粉漿水解液的吸光度呈線性急劇上升;鹽酸濃度為0.30 mol/L時，水解液的吸光度達到最大值;當鹽酸濃度大于0.3 mol/L時，隨著鹽酸濃度的增大，水解液的吸光度呈緩慢下降趨勢．其原因在于鹽酸濃度增大，毛薯水解液中的還原糖分解嚴重，吸光度便下降．因此毛薯粉漿水解較佳的鹽酸濃度為0.3 mol/L．

2.5 水解時間對毛薯粉漿水解的影響

準確稱取5.000 0 g毛薯干粉于三頸燒瓶中，分別按1∶16料液比(g/mL)加入0.3 mol/L鹽酸溶液，調(diào)成粉漿．裝上回流冷凝管，水解溫度103℃，水解時間為0.5～3.0 h，按0.5 h增序．水解液用氫氧化鈉溶液中和，轉(zhuǎn)入250 mL容量瓶，加蒸餾水稀釋定容．準確吸取5.00 mL水解稀釋液于100 mL容量瓶，加蒸餾水稀釋定容，搖勻．準確吸取1.0 mL水解稀釋液于50 mL容量瓶，按1.6中方法，選擇1 cm比色皿，于480 nm處測定其吸光度，結(jié)果見圖4．

圖4 水解時間對毛薯粉漿水解的影響Fig．4 Effects of hydrolytic time of dry powder of Dioscorea esculenta(Lour．)brukill

由圖4可以看出，隨著水解時間的延長，毛薯粉漿水解液的吸光度呈線性上升．水解時間為2.0 h時，水解液的吸光度達到最大值．當水解時間大于2.0 h時，繼續(xù)延長水解時間，水解液吸光度幾乎保持不變，可認為水解時間大于2.0 h后，毛薯中的多糖幾乎全部水解，再延長水解時間，對水解液吸光度的影響不大，甚至有下降的趨勢．主要是因為反應體系中副產(chǎn)物的增加，導致還原糖自身的分解及與副反應產(chǎn)物進行縮合反應所致的［11］．所以優(yōu)化水解時間以2.0 h為宜．

2.6 料液比對毛薯粉漿水解的影響

準確稱取5.000 0 g毛薯干粉于三頸燒瓶中，分別按料液比(g/mL)1∶5，1∶10，1∶16，1∶20，1∶25，1∶30的比例加入0.3 mol/L鹽酸溶液，調(diào)成粉漿．裝上回流冷凝管，水解溫度103℃，水解時間2.0 h．水解液用氫氧化鈉溶液中和，轉(zhuǎn)入250 mL容量瓶，加蒸餾水稀釋定容．分別準確吸取5.0 mL水解稀釋液于100 mL容量瓶，加蒸餾水稀釋定容，搖勻．準確吸取1.0 mL水解稀釋液于50 mL容量瓶，按1.6中方法，選擇1 cm比色皿，于480 nm處測定其吸光度，結(jié)果見圖5．

圖5 料液比對毛薯干粉水解的影響Fig．5 Effects of ratio of material-liquid on hydrolysis of dry powder of Dioscorea esculenta(Lour．)brukill

從圖5可以看出，料液比小于1∶16時，隨著料液比的增大，毛薯粉漿水解液的吸光度呈上升趨勢．因為料液比的大小決定了水解液的流動性，當比例小于1∶16時，水解液黏度過高，流動性差，鹽酸中的氫離子作用于淀粉鏈內(nèi)部葡萄糖糖苷鍵上氧原子的幾率較小，所以會導致水解效果不佳［12］．當料液比為1∶16時，水解液的吸光度達到最大值．料液比大于1∶16時，隨著料液比的增大，水解液的吸光度緩慢下降．主要是由于隨著料液比的增大，底物可被充分水解，但是過多的H+則會使得水解后的還原糖進一步分解．因此優(yōu)化料液比為1∶16．

2.7 水解溫度對毛薯粉漿水解的影響

準確稱取5.000 0 g的毛薯干粉于三頸燒瓶，按料液比1∶16的比例，分別加入0.3 mol/L鹽酸溶液，調(diào)成粉漿．裝上磨口玻璃塞，置于不銹鋼高反應壓釜中，水解溫度為105～135℃，按5℃的溫度增序，水解時間2.0 h．水解液用氫氧化鈉溶液中和，轉(zhuǎn)入250 mL容量瓶，加蒸餾水稀釋定容．分別準確吸取5.0 mL水解稀釋液于100 mL容量瓶，加蒸餾水稀釋定容，搖勻．準確吸取1.0 mL水解稀釋液于50 mL容量瓶，按1.6中方法，選擇1 cm比色皿，于480 nm處測定其吸光度，結(jié)果見圖6．

圖6 水解溫度對毛薯干粉水解的影響Fig．6 Effects of hydrolytic temperature on dry powder of Dioscorea esculenta(Lour．)brukill

從圖6可以看出，水解溫度小于110℃時，隨著水解溫度的增大，毛薯粉漿水解液的吸光度急劇增大，而后趨于平緩．水解溫度為110℃時，吸光度穩(wěn)定在高值．水解溫度大于110℃時，水解液的吸光度緩慢下降，水解液的色澤逐漸加深．表明水解溫度升高，會加速鹽酸中H+作用于葡萄糖糖苷鍵上的氧原子，進而使水解液中還原糖分解嚴重［12］．因此水解溫度采用110℃．

2.8 重現(xiàn)性實驗結(jié)果

準確稱取5.000 0 g毛薯干粉，按料液比為1∶16比例加入0.3 mol/L的鹽酸溶液，調(diào)成粉漿．裝上磨口玻璃塞，置于不銹鋼高壓反應釜中，水解溫度110℃，水解時間2.0 h．水解液用氫氧化鈉溶液中和，轉(zhuǎn)入250 mL容量瓶，加蒸餾水稀釋定容．分別準確吸取5.0 mL水解稀釋液于100 mL容量瓶，加蒸餾水稀釋定容，搖勻．準確吸取1.0 mL水解稀釋液于50 mL容量瓶，按1.6中方法，選擇1 cm比色皿，于480 nm處測定其吸光度，其結(jié)果見表3．

表3 毛薯還原糖測定的重復性實驗結(jié)果Tab．3 Results of repeatability experiment on determination of reducing saccharidein from Dioscorea esculenta(Lour．)brukill

從表3可以看出，標準偏差為±0.006 7，相對平均標準偏差為±2.15%，重現(xiàn)性好，相對誤差小，根據(jù)標準回歸曲線和計算公式，可計算出毛薯干粉中總還原糖的含量為71.08%．將毛薯干粉中總還原糖含量，乘以0.9便可得到毛薯干粉中淀粉含量為 63.97%［13］．

2.9 標準回收實驗結(jié)果

準確稱取5.000 0 g毛薯干粉于三頸燒瓶中，按料液比為1∶16比例加入0.3 mol/L的鹽酸溶液，調(diào)成粉漿．裝上磨口玻璃塞，置于不銹鋼高壓反應釜中，水解溫度110℃，水解時間2.0 h．水解液用氫氧化鈉溶液中和，轉(zhuǎn)入250 mL容量瓶，加蒸餾水稀釋定容．準確吸取5.0 mL水解稀釋液于100 mL容量瓶，加蒸餾水稀釋定容，搖勻．分別準確吸取1.0 mL水解稀釋液于50 mL容量瓶，加入1 mg/mL標準葡萄糖溶液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mL，按1.6 中方法，選擇1 cm比色皿，于480 nm處測定其吸光度，計算水解液中葡萄糖的標準回收率［14］，結(jié)果見表4．

表4 毛薯干粉中總還原糖測定標準回收實驗結(jié)果Tab．4 Results of recovery experiment of reducing saccharide in spiked Dioscorea esculenta(Lour．)brukill

由表4可以看出，采用葡萄糖為標準溶液，DNS作顯色劑，測定毛薯干粉中總還原糖的含量，標準回收率最高為101.9%，最低為99.7%，相對誤差為±1.9%，相對誤差?。?5］，標準回收率高，效果好．

3 結(jié)論

用分光光度法可測定海南毛薯干粉中總還原糖的含量．毛薯經(jīng)曬干或烘干，粉碎至80～100目，按料液比1∶16的比例，加入0.3 mol/L鹽酸溶液，調(diào)成粉漿，水解溫度110℃，水解時間2.0 h，水解液用氫氧化鈉溶液中和，水解液不需分離，直接用葡萄糖作標準溶液，用3，5-二硝基水楊酸溶液作顯色劑，于沸水浴中加熱顯色，迅速冷卻，加蒸餾水稀釋定容，于480 nm處測定其吸光度．測定回收率最大為101.9%，最小為99.7%，相對誤差為±1.9%．實測得毛薯干粉中總還原糖含量為71.08%，毛薯中淀粉含量為63.97%．

［1］王茀能，汪飛杰，王天云，等．海南島大薯、毛薯等資源考察報告［P］．作物品種資源，1991，2(3):8．

［2］黃廣民，劉秋實．香/芭蕉根部球莖干粉中還原糖含量的測定［J］．食品科學，2008，29(8):485-488．

［3］羅志剛，曾滿枝，凌晨，等．3，5二硝基水楊酸比色法測定煙草中水溶性總糖［J］．中國煙草科學，2000(2):34-36．

［4］守正祥．食品分析手冊［M］．北京:中國輕工業(yè)出版社，1998．

［5］許慶芬，呂文河，石瑛，等．馬鈴薯塊莖還原糖的測定方法比較［J］．中國馬鈴薯，2004，6(18):338-340．

［6］趙凱，許鵬舉，谷廣燁．3，5一二硝基水楊酸比色法測定還原糖含量的研究［J］．食品科學，2008，29(8):534-536．

［7］大連輕工業(yè)學院，華東理工大學，鄭州輕工業(yè)學院，等．食品分析［M］．北京:中國輕工業(yè)出版社，1999．

［8］馬延和，周培謹．淺談寡糖的開發(fā)和應用［J］．食品與發(fā)酵工業(yè)，1992(1):80-82．

［9］Nagie N，Ibsen K，Jennings E．A process economic approach todevelop adilute-acid cellulose hydrolysis process to produce ethanol from biomass［J］．Appl Biochem Biotechnol，1999(77/79):599-607．

［10］林穎，吳毓敏．天然產(chǎn)物中的糖含量測定方法正確性的研究［J］．天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，1996，8(4):5-9．

［11］余先純，孫德林，李湘蘇．微波固體酸聯(lián)合水解棉籽殼制備還原糖的研究［J］．食品工業(yè)科技，2011，32(1):207-211．

［12］陳偉．香蕉根球莖粉漿糖化工藝研究［D］．?？?海南大學，2011．

［13］張惟杰．糖復合物生化研究技術(shù)［M］．杭州:浙江大學出版社，1994:14．

［14］孫偉偉，曹維強，王靜．DNS法測定玉米秸稈中總糖［J］．食品研究與開發(fā)，2006(6):120-124．

［15］華東理工大學化學系，四川大學化工學院．分析化學［M］．北京:高等教育出版社，2003(7):7-10．

［16］Miller G L．Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar［J］．Anal Chem，1959，31(3):426-428．

［17］李誼軒，黃廣民．參薯干粉中總還原糖含量的測定［J］．食品科技，2011，36(9):322-326．

(責任編輯:葉紅波)

Determination of Total Reducing Saccharide in Hainan Dioscorea Esculenta(Lour．)brukill

HE Jiao，HUANG Guang-min
(College of Food Science，Hainan University，Haikou 570228，China)

Using glucose as standard and DNS as color developing reagent，the content of total reducing saccharide in Hainan Dioscorea esculenta(Lour．)brukill was determined by spectrophotometry．The results showed that the maximum absorption wavelength of the sample was 480nm．The maximum recovery rate was determined as 101.9%，and the minimum was 99.7%．The relative error was±1.9%．The content of total reducing saccharide and starch in Hainan Dioscorea esculenta(Lour．)brukill was 71.08%and 63.97%，respectively．

Hainan Dioscorea esculenta(Lour．)brukill;reducing saccharide;spectrophotometry

TS201;TS215

A

1671-1513(2012)05-0056-06

2012-04-06

?？谑兄攸c科技計劃項目(0000017)．

何 嬌，女，碩士研究生，研究方向為糖及碳水化合物化學和生物質(zhì)能源;

黃廣民，男，教授，主要從事糖及碳水化合物化學和生物質(zhì)能源方面的研究．通訊作者．