CXCR4和MMP－9在胃癌組織中表達(dá)及其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

徐 斌 韓紹偉 周笑珍 李立義 蔣 平

胃癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率均居我國消化道惡性腫瘤的首位。復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是胃癌死亡最主要的原因，其中淋巴轉(zhuǎn)移是其最常見的轉(zhuǎn)移方式之一，但分子生物學(xué)機(jī)制仍不十分明確。研究發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，對腫瘤分期和治療有重要意義［1］。CXC趨化因子受體4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)是趨化因子家族重要成員，通過與其配體CXCLl2間的相互作用在包括胃癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用［2］?；|(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase－9，MMP－9)是一種能降解細(xì)胞外基膜及其他細(xì)胞外基質(zhì)成分的重要蛋白酶，具有促進(jìn)腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的作用。胃癌組織中CXCR4與MMP－9表達(dá)與淋巴轉(zhuǎn)移的關(guān)系及其相關(guān)性目前尚鮮見報(bào)道。本研究應(yīng)用(RT－PCR)及S－P免疫組化方法檢測CXCR4和MMP－9在30例無淋巴轉(zhuǎn)移與46例有淋巴轉(zhuǎn)移人胃癌組織中的表達(dá)水平，并探討CXCR4和MMP－9的表達(dá)及與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系及兩者相關(guān)性。

材料與方法

1．材料:76例胃癌組織標(biāo)本取自2009年12月～2010年12月在筆者醫(yī)院普外科行手術(shù)切除術(shù)患者，其中男性52例，女性24例，患者年齡26～79(57．0±1．8)歲，術(shù)前均未行放化療，所有病例術(shù)前病例學(xué)證實(shí)為胃癌。腫瘤分期按照2002年國際抗癌聯(lián)盟(U1CC)頒布的胃癌TNM分期方案:PN030例，PN135例，PN26例，PN35例。每份標(biāo)本于術(shù)后10min內(nèi)取材于腫瘤組織，正常組織(距腫瘤組織邊緣＞5cm，做正常對照)。全部標(biāo)本取材后迅速分成兩份，分別置于10%中性甲醛中固定和－80℃冰箱保存，備用。

2．試劑:鼠抗人CXCR4抗體購至美國Sigma公司，兔抗人MMP－9抗體購自美國Epitomics公司，免疫組化S－P試劑盒購自德國寶靈曼公司。CXCR4，MMP－9引物由北京奧科生物技術(shù)公司設(shè)計(jì)?？俁NA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于美國Gibico BRL公司。

3．方法:(1)S－P法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色法檢測CXCR4和MMP－9蛋白表達(dá):組織切片脫、蠟脫水及雙氧水室溫孵育后，組織抗原修復(fù)10min(用pH 6．0的0．01mol/L檸檬酸緩沖液，于微波爐中94℃加熱，每次5min，共2次)，滴加一抗和二抗。DAB顯色，顯微鏡下控制染色程度。操作過程中嚴(yán)格質(zhì)控。用已知陽性的胃癌切片作為陽性對照，用PBS代替一抗，作為陰性對照。(2)免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷:CXCR4和MMP－9均為胞膜或胞質(zhì)表達(dá)，以細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)呈棕黃或棕褐色者為陽性細(xì)胞，隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野(×400)，每個(gè)視野讀取200個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽性率，并取平均值。所有切片均用盲法計(jì)數(shù)。陽性表達(dá)判斷參照Mattern等［3］的計(jì)數(shù)方法。(3)反轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)(RT－PCR)檢測CXCR4mRNA和MMP－9mRNA表達(dá):胃癌標(biāo)本從－80℃冰箱內(nèi)取出后，迅速置于研缽中，在液氮中研磨為粉末狀，按試劑盒操作說明提前總RNA。取2μg總RNA，用MMLV反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(GIBGO－BRL)合成cDNA，以3－磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)對照。擴(kuò)增引物為:CXCR4前向引物5'－AAGAAACTGAGAAGCATGACC－3'，后向引物 5'－GAAACTGGAACACAACCACC－3'，擴(kuò)增片段大小為406bp。MMP－9前向引物5'－TCAGGGAGACGCCCATTT－3'，后向引物5'－TCGGGCAGAAGCCGAAG－3'，擴(kuò)增片段大小為398bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像系統(tǒng)成像，并確定條帶光密度值。

4．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用SPSS15．0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。采用Fisher確切概率法分析MMP－9和CXCR4表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性;MMP－9與CXCR4相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearman等級相關(guān)分析。p＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．CXCR4和MMP－9蛋白在胃癌組織中的表達(dá):CXCR4在癌旁正常胃組織中無陽性表達(dá)，在pN0組胃癌組織中陽性表達(dá)率26．67%(8/30)。MMP－9在癌旁正常胃組織陽性表達(dá)率為15．79%(12/76)，在pN0組胃癌組織中陽性表達(dá)率46．67%(14/30)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0．05)。依據(jù)2002年國際抗癌聯(lián)盟(U1CC)頒布的胃癌TNM分期，pN0胃癌組織中CXCR4和 MMP－9的陽性表達(dá)率(15．79%和46.67%)與 pN1組(65．71%和 74．29%)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.873，P=0.002 和 χ2=5.206，P=0.023);且顯著低于pN2+pN3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0．05)(MMP－9陽性表達(dá)在pN1和pN2+pN3間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P=0．061)。pN2組，pN3組CXCR4和MMP－9在胃癌組織中的陽性表達(dá)率分別為，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。各組腫瘤組織切片經(jīng)PBS代替特異性一抗作為空白對照，腫瘤組織鏡下均無陽性表達(dá)。見圖1、圖2、表1。

表1 CXCR4和MMP－9在不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織中的表達(dá)

2．CXCR4mRNA和MMP－9mRNA在胃癌組織中的表達(dá):如圖 3所示，MMP－9mRNA和 CXCR4mRNA在胃癌組織中的表達(dá)隨淋巴轉(zhuǎn)移增加而表達(dá)明顯上調(diào)。

圖3 CXCR4和MMP－9的表達(dá)與淋巴轉(zhuǎn)移關(guān)系

3．經(jīng)Spearman等級相關(guān)分析:胃癌組織CXCR4的陽性表達(dá)水平與MMP－9的陽性表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0．406，P ＜0．01)，見表 2。

表2 胃癌中CXCR4與MMP－9表達(dá)的關(guān)系

討 論

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響胃癌患者根治術(shù)后生存率的最重要因素之一，并且淋巴管浸潤是獨(dú)立的死亡危險(xiǎn)因素之一，其中MLR與胃癌患者術(shù)后生存時(shí)間存在直線關(guān)系［4］。因此早期發(fā)現(xiàn)及阻斷胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，從而提高患者預(yù)后值得我們進(jìn)一步研究。

CXC趨化因子受體4(CXC chemokine receptor4，CXCR4)是一個(gè)編碼352個(gè)氨基酸且高度保守的G蛋白偶聯(lián)7次跨膜受體，與其特異性配體CXCLl2所構(gòu)成的CXCL12/CXCR4生物學(xué)軸(CXCL12/CXCR4 biological axis)在多種腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［5］。惡性腫瘤細(xì)胞高表達(dá)趨化因子受體 CXCR4，并可能在CXCL12趨化、牽引下致使腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移至作為配體產(chǎn)生源的某些器官(如肺、骨、肝、腎、淋巴結(jié)等)，從而形成器官特異性的轉(zhuǎn)移［6］。Kato等［7］研究發(fā)現(xiàn)CXCR4與乳腺癌的侵襲及轉(zhuǎn)移相關(guān)，并且可能促進(jìn)乳腺癌的淋巴轉(zhuǎn)移。有研究證明CXCR4促進(jìn)子宮頸癌向盆腔淋巴結(jié)組織轉(zhuǎn)移［8］。本實(shí)驗(yàn)中，免疫組織化學(xué)法檢查結(jié)果顯示，CXCR4陽性在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中陽性表達(dá)率為73.91%，明顯高于無轉(zhuǎn)移者(36．37%)，并且在pN2+pN3組表達(dá)明顯高于pN1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0．05)。筆者還發(fā)現(xiàn)，隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移增加 CXCR4 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)(p＜0．05)。以上結(jié)果提示趨化因子受體CXCR4的表達(dá)可能促進(jìn)胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其可能機(jī)制為胃癌組織高表達(dá)CXCR4與淋巴結(jié)選擇性高表達(dá)CXCR4特異性配體CXCL12，從而促進(jìn)腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移。另外，Iwanaga等發(fā)現(xiàn)，表達(dá)CXCR4的人胃癌裸鼠模型經(jīng)CXCR4拮抗劑AMD3100治療后的，腫瘤容積較對照組減小27．6%，且未見明顯的毒性癥狀。因此，阻斷CXCR4蛋白信號途徑可能是治療胃癌及其轉(zhuǎn)移的有效策略。

MMP－9(基質(zhì)金屬蛋白酶－9)是MMP－s(基質(zhì)金屬蛋白酶)家族的重要成員之一，在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。激活狀態(tài)的MMP－9調(diào)節(jié)ECM的降解過程，水解細(xì)胞基膜及外基質(zhì)中的Ⅳ型、Ⅴ型膠原和凝膠、彈力蛋白成分，導(dǎo)致基膜破壞，腫瘤細(xì)胞浸潤結(jié)締組織基質(zhì)，侵入小血管和淋巴管而發(fā)生轉(zhuǎn)移。最近發(fā)現(xiàn)，MMP－9在胃黏膜的表達(dá)是胃癌發(fā)生的晚期事件，是胃黏膜上皮細(xì)胞發(fā)生惡變的標(biāo)志，其過度表達(dá)對胃癌的發(fā)生，發(fā)展起重要作用［9］。本實(shí)驗(yàn)中，免疫組化結(jié)果顯示，MMP－9在人胃癌組織的陽性表達(dá)率明顯高于正常胃組織(p＜0．05)，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者高于無轉(zhuǎn)移組(p＜0．05)。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移增加MMP－9 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)(p＜0．05)。說明MMP－9與胃癌的發(fā)生及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，且MMP－9高表達(dá)的胃癌組織具有較強(qiáng)的淋巴管侵襲及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移能力;MMP－9可作為評估胃癌惡性程度的及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的一個(gè)指標(biāo)。

分析CXCR4和MMP－9的表達(dá)與胃癌淋巴轉(zhuǎn)移的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，伴有淋巴轉(zhuǎn)移的胃癌組織的CXCR4和MMP－9的陽性表達(dá)明顯高于無轉(zhuǎn)移者，隨著胃癌淋巴轉(zhuǎn)移的分期增加，CXCR4和MMP－9的表達(dá)相應(yīng)上調(diào)。在CXCR4表達(dá)上調(diào)的胃癌組織，MMP－9表達(dá)亦相應(yīng)上調(diào)。以上結(jié)果提示CXCR4和MMP－9的高表達(dá)可能是胃癌淋巴轉(zhuǎn)移的重要分子標(biāo)志。兩者在介導(dǎo)胃癌的淋巴轉(zhuǎn)移間具有協(xié)同效應(yīng)，然而關(guān)于兩者在介導(dǎo)胃癌淋巴轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制的研究未見報(bào)道。進(jìn)一步研究CXCR4和MMP－9在胃癌淋巴轉(zhuǎn)移中的相互作用及其機(jī)制，有助于進(jìn)一步闡明胃癌淋巴轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制，可能為評估胃癌的淋巴轉(zhuǎn)移情況提供分子標(biāo)志物，并為進(jìn)一步治療和預(yù)防胃癌的淋巴轉(zhuǎn)移提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究表明CXCR4和MMP－9的表達(dá)與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，并隨淋巴轉(zhuǎn)移的分期增加其陽性表達(dá)明顯上調(diào)，而且兩者之間存在協(xié)同效應(yīng)。因此筆者推測，CXCR4和MMP－9可能共同介導(dǎo)胃癌的淋巴轉(zhuǎn)移。但其具體機(jī)制尚未明確，有待進(jìn)一步研究。

1 Degiuli M，Borasi A，F(xiàn)orchino F，et al．Lymph－nodal ratio in gastric cancer staging system［J］．Minerva Chir，2011，66(3):177 －182

2 Balkwill F．The significance of cancer cell expression of the chemokine receptor CXCR4［J］．Semin Cancer Biol，2004，14:171 －179

3 Mattern J，Koomagi R，Volm M．Associalion of vascular endothelial growth factor expression with intratumoral microvessel densilv and tumour cell proliferation in human epidermoid lung carcinoma［J］．Br JCancer，1996，73(7):931 －934

4 吳巨鋼，倪曉春，俞繼衛(wèi)，等．胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率和預(yù)后的關(guān)系［J］．中華胃腸外科雜志，2009，12(2):202 －203

5 呂明，趙文華．CXCL12－CXCR4生物學(xué)軸在腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移中的研究進(jìn)展［J］．國際腫瘤學(xué)雜志，2008，35(2):90 －92

6 Saur D，Seidler B，Schneider G，et al．CXCR4 expression increases liver and lung metastasis in a mouse model of pancreatic cancer［J］．Gastroenterology，2005，129(4):1237－1250

7 Kato M，Kitayama J，Kazama S，et al．Expression pattern of CXC chemokine receptor－4 is correlated with lymph node metastasis in human invasive ductal carcinoma ［J］．Breast Cancer Res，2003，5(5):R144－R150

8 蘇一樂，宋靜慧，吉亞南．子宮頸癌和盆腔淋巴結(jié)組織中趨化因子受體CXCR4及其配體CXCL12基因DNA的表達(dá)及其意義［J］．中華婦產(chǎn)科雜志，2006，41(10):717－719

9 姬瑞，周永寧，任濤文，等．MMP－9在胃癌及其淋巴結(jié)組織中表達(dá)的臨床意義［J］．中國腫瘤臨床，2010，37(7):377－380